基于HIV-1 gp41 NHR結(jié)構(gòu)域的亞單位疫苗及融合抑制劑研究.pdf

1、研究背景:
　　 HIV主要感染人類(lèi)免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細(xì)胞，特征性地引起CD4+T細(xì)胞逐步減少和進(jìn)行性免疫缺陷，進(jìn)而誘發(fā)艾滋?。ǐ@得性免疫缺陷綜合征），導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染并最終導(dǎo)致死亡。雖然高效抗逆轉(zhuǎn)錄藥物在控制病毒復(fù)制，減緩疾病進(jìn)程方面取得了顯著的進(jìn)展，但昂貴的治療費(fèi)用、耐藥株的出現(xiàn)、藥物的副反應(yīng)等，嚴(yán)重阻礙了其持久廣泛地應(yīng)用。尤其是在感染人數(shù)眾多的亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家，研制有效的疫苗是控制艾滋病蔓延的最佳途徑，也是當(dāng)前科

2、研工作者的緊迫任務(wù)。
　　 艾滋病疫苗是當(dāng)今時(shí)代最具挑戰(zhàn)性的科學(xué)難題之一，現(xiàn)有的以誘導(dǎo)體液免疫為目的的HIV-1抗原均難以誘導(dǎo)有效的、持續(xù)的廣譜中和抗體。誘導(dǎo)HIV體液免疫反應(yīng)的疫苗主要是采用HIV-1包膜糖蛋白作為免疫原。HIV-1包膜蛋白基因全長(zhǎng)約2.6kb，是HIV-1變異性最強(qiáng)的基因，編碼病毒的包膜糖蛋白(Env)，翻譯后形成前體蛋白gp160，經(jīng)蛋白酶裂解成跨膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。三分子的gp120/gp

3、41共同形成病毒包膜上的突起，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。因此，gp120和gp41在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和抗體，促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。
　　 近年來(lái)，一些具有廣譜中和活性的人源mAb，如2F5、4E10、Z13、PG16、VRC01等的發(fā)現(xiàn)及其相應(yīng)抗原表位的闡明，給以誘導(dǎo)HIV中和抗體為目標(biāo)的艾滋病疫苗研究帶來(lái)了新的希望。這些中和抗體的抗原表位靶向HIV包膜糖蛋白gp120和gp41。由于gp41比gp12

4、0的序列更為保守及較少的糖基化位點(diǎn)，基于gp41的HIV亞單位疫苗可能比基于gp120的HIV亞單位疫苗具有更強(qiáng)更廣譜的保護(hù)作用。為此，本文對(duì)源于gp41NHR區(qū)域的抗原進(jìn)行改造，選擇gp41NHR結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)序列作為免疫原，并使之與能天然形成三聚體的噬菌體Fd片段或人IgGFc片段融合，構(gòu)建了重組蛋白N63Fc和N51FdFc。這些蛋白能穩(wěn)定存在于溶液中，并維持天然的三聚體構(gòu)象，盡管未能誘導(dǎo)中和抗體，但具有很強(qiáng)的免疫原性。此外，這些三

5、聚體蛋白本身還能抑制HIV-1的感染，阻止HIV病毒的早期進(jìn)入。這為今后研制針對(duì)變異快速，多樣性復(fù)雜的艾滋病病毒的HIV疫苗和HIV融合抑制劑提供了新思路。
　　 方法和結(jié)果:
　　 一、基于HIV-1gp41包膜糖蛋白NHR結(jié)構(gòu)域的N63Fc融合蛋白的研究
　　 1.pGEX/N63Fc表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 運(yùn)用常規(guī)PCR方法，以pHXB2-env質(zhì)粒為模板，用上、下游引物N63fuEcos和N63fu

6、bga擴(kuò)增N63基因片段。EcoRⅠ和BgIⅡ雙酶切表達(dá)載體pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)和N63基因的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行目的基因和質(zhì)粒的連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐霉素的平板，次日挑取單克隆菌落接種子3mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定并送樣測(cè)序，正確的陽(yáng)性克隆命名為pFUSE/N63。
　　 再以pFUSE/N63陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，用上、下游引

7、物N63FCbms和N63FCEcoa進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得N63Fc基因片段。BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切表達(dá)載體pGEX-6p-1和N63Fc基因的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行目的基因和質(zhì)粒的連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐霉素的平板，次日挑取單克隆菌落接種于3mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定并送樣測(cè)序，正確的陽(yáng)性克隆命名為pGEX/N63Fc。
　　 2、N63Fc融

8、合蛋白的表達(dá)
　　 以pGEX/N63Fc陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2(DE3)表達(dá)載體，挑單克隆，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，再按1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)后，分別收集上清和沉淀，用適量PBS重懸沉淀。取上清和菌體沉淀，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離總蛋白，并電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以兔抗NY363為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行WesternBlot免疫印跡分析。結(jié)果表明，N63Fc融合蛋白在

9、大腸桿菌中得到高效表達(dá)，可被兔抗NY363特異性識(shí)別，反應(yīng)條帶的大小與推算的分子量33KD相符，表明N63Fc重組蛋白在大腸桿菌體系得到成功表達(dá)。
　　 3、N63Fc融合蛋白的活性檢測(cè)
　　 1)N63Fc融合蛋白天然構(gòu)象的分析
　　 N-PAGE方法區(qū)別于常規(guī)的SDS-PAGE，在于不加SDS而且不需要對(duì)樣品進(jìn)行加熱變性處理，因此N-PAGE中樣品的移動(dòng)與其分子量和電荷相關(guān)。我們對(duì)N63Fc融合蛋白進(jìn)行了熱變

10、性處理，并用N-PAGE方法檢測(cè)了N63Fc融合蛋白的天然構(gòu)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)煮的N63Fc融合蛋白變性后成一條帶;不煮的N63Fc融合蛋白卻有三條帶，表明天然的N63Fc蛋白呈現(xiàn)三聚體構(gòu)象，具有一定的生物學(xué)活性。
　　 2).圓二色譜法分析N63Fc蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)
　　 我們采用圓二色譜法檢測(cè)了N63Fc蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明單獨(dú)的N63多肽沒(méi)有α-helicity結(jié)構(gòu)，N63Fc蛋白顯示了復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但當(dāng)N63Fc蛋

11、白與C34孵育后形成了α-helicity結(jié)構(gòu)，而且N63Fc-trimer比N63多肽更易于和C34多肽相互作用，形成α-helicity結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng)。但C34/N36復(fù)合物的α-helicity結(jié)構(gòu)比C34/N63Fc更好。
　　 3).N63Fc融合蛋白抑制了H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞與MT-2細(xì)胞的早期融合H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞和MT-2細(xì)胞用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3

12、d傳代1次。先對(duì)H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞進(jìn)行分子熒光探針Calcein-AM熒光染色，按1mLH9/HIV-1ⅢB細(xì)胞加入2.5ul1mmol/LCalcein-AM。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞，計(jì)數(shù)并配制4×108/L細(xì)胞懸液。然后將Calcein-AM標(biāo)記的H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞加到96孔板，每孔25ul細(xì)胞懸液，分別加入2倍倍比稀釋的N63Fc融合蛋白或N63多肽，另外設(shè)不加藥物的病毒對(duì)照組和T20陽(yáng)性對(duì)照組，每組

13、樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育30min。接下來(lái)每孔加入50ul處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MT-2細(xì)胞(細(xì)胞濃度2×109/L)，同時(shí)設(shè)僅加MT-2細(xì)胞的空白對(duì)照。37℃孵育2h后在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的融合，每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，取均值，計(jì)數(shù)不同稀釋度下的融合細(xì)胞數(shù)。
　　 MT-2細(xì)胞具有CD4受體，H9/HIV-1ⅢB和MT-2細(xì)胞混合后在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞被CalceinAM染色后，能發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，

14、而體積較小，單獨(dú)的MT-2細(xì)胞沒(méi)有染色不能發(fā)出熒光。H9/HIV-1ⅢB和MT-2細(xì)胞共同孵育2h后，如發(fā)生融合，則MT-2與H9/HIV-1ⅢB融合細(xì)胞能發(fā)出熒光，但熒光強(qiáng)度弱于未融合的H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞（熒光素?cái)U(kuò)散到兩個(gè)細(xì)胞），細(xì)胞體積較大，因此很易區(qū)分融合和未融合細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示游離的N63多肽對(duì)HIV的進(jìn)入沒(méi)有阻止作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白可顯著阻止HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞，其抑制IC50為

15、82nM，與T20的抑制率接近(P＜0.05)。
　　 4)N63Fc融合蛋白能中和HIV-1ⅢB和HIV-1Bal活病毒感染
　　 MT-2細(xì)胞于37C、5％CO2培養(yǎng)，每隔3天傳代一次。當(dāng)MT-2細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將HIV-1ⅢB病毒按一定滴度與2倍倍比稀釋的N63Fc融合蛋白或N63多肽于37℃共孵育1h，然后加入MT-2細(xì)胞，其中設(shè)立已知中和滴度的陽(yáng)性對(duì)照孔作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，隔天換液一次，37℃再培養(yǎng)3d。離心9

16、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液做p24抗原檢測(cè)（按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。結(jié)果表明游離的N63多肽對(duì)HIV的進(jìn)入沒(méi)有阻止作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白顯著抑制了HIVp24抗原表達(dá)，其抑制IC50為133nM，抑制活性接近T20(P＜0.05)。
　　 TZM-b1細(xì)胞于37℃、5％CO2培養(yǎng)，每隔3天傳代一次。當(dāng)TZM-b1細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將Bal病毒按一定滴度與2倍倍比稀釋的N63Fc融合蛋

17、白或N63多肽于37℃共孵育1h，然后加入TZM-b1細(xì)胞，其中設(shè)立已知中和滴度的陽(yáng)性對(duì)照孔作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，37℃再培養(yǎng)3d。結(jié)果表明游離的N63多肽對(duì)HIV的感染沒(méi)有抑制作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白顯著抑制了HIV-1Bal病毒的感染，IC50為103nM，抑制活性也接近T20(P＜0.05)。本文的研究工作為基于HIV-1gp41NHR區(qū)域的融合抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。
　　 二、N63Fc融合蛋白

18、作為亞單位疫苗的初步免疫學(xué)研究
　　 BALB/c雌性小鼠24只，5周齡，分為3個(gè)免疫組和一個(gè)空白對(duì)照組，每組6只。以20ug的抗原劑量免疫小鼠4次，空白對(duì)照組不注射抗原。在第1、30、50、57天免疫后，收集血清用于抗體滴度檢測(cè)。結(jié)果表明抗原能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)N63Fc重組蛋白的特異性抗體，最高抗體效價(jià)可達(dá)到106。
　　 為了檢測(cè)抗N63Fc血清是否具有中和HIV活病毒的作用，我們?nèi)〉谌蚊庖吆蟮难灏?:20的比例

19、稀釋?zhuān)凑罩泻驮囼?yàn)操作方法進(jìn)行HIV-1ⅢB和Bal實(shí)驗(yàn)室株中和試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組的抑制率分別是31％和36％，F(xiàn)c組的抑制率是35％，而N63Fc組的抑制率是32％。通過(guò)比較，可以認(rèn)為N63FC融合蛋白的免疫血清沒(méi)有中和ⅢB病毒的活性。同樣的，當(dāng)免疫血清1:20稀釋時(shí)，陰性對(duì)照組對(duì)HIV-1Bal病毒的抑制率分別是35％和31％，F(xiàn)c組的抑制率是31％，而N63Fc組的抑制率是33％(P＜0.05)。本文研究結(jié)果表明N63Fc融

20、合蛋白能誘導(dǎo)小鼠的特異性體液反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體效價(jià)高，特異性強(qiáng)，而且這種抗體能識(shí)別HIV-1gp41NHR的疏水口袋區(qū)域，但這種抗體不能抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，也不能抑制HIV-1ⅢB和Bal活病毒株的感染。
　　 在抗體交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，抗N63Fc的血清并不能很好地識(shí)別IQN17這個(gè)源于gp41NHR(N17)的三聚體，為此我們認(rèn)為可能是因?yàn)檫@個(gè)疫苗的空間結(jié)構(gòu)不好，因而不能發(fā)揮更好的作用，為此我們重新設(shè)計(jì)了源于gp41NHR的疫苗

21、。
　　 三、基于HIV-1gp41包膜糖蛋白NHR結(jié)構(gòu)域N51FdFc重組蛋白的功能研究
　　 1.pFUSE/N51Fd表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 首先運(yùn)用CO-PCR方法，以pNBJ-3質(zhì)粒為模板，用上、下游引物擴(kuò)增N51ⅢB基因片段，第二步以Foldon片段和第一步產(chǎn)物為模板擴(kuò)增N51Fd-ⅢB基因。
　　 采用引物自連的方法先擴(kuò)增N51-BC的部分片斷，再以第一步產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出N51-BC基因，第三

22、步以foldon片段和第二步產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出N51Fd-BC基因。同樣的，采用引物自連的方法擴(kuò)增N51-AE的部分片斷，再以第一步產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出N51-AE基因，第三步以foldon片段和第二步產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出N51Fd-AE基因。然后將目的基因分別插入到真核表達(dá)載體pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFUSE/N51F。EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)和N51Fd基因

23、的PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行目的基因和質(zhì)粒的連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含博來(lái)霉素的平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。次日挑取單克隆菌落接種于3mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定和送樣測(cè)序，正確的陽(yáng)性克隆命名為pFUSE/N51Fd。結(jié)果顯示，N51ⅢB-Fd、N51BC-Fd和N51AE-Fd的引物擴(kuò)增了目的基因片段，在253bp處出現(xiàn)了目的基因條帶。
　　 2、N51F

24、dFc重組蛋白的表達(dá)
　　 以測(cè)定的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48h后，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后重組蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)。取細(xì)胞培養(yǎng)上清，運(yùn)用proteinA親和柱純化N51FdFc重組蛋白。
　　 3、N51FdFc重組蛋白的活性檢測(cè)
　　 1)N51FdFc蛋白的特異性檢測(cè)
　　 分離總蛋白，取25μg蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以NY363為一抗，HRP標(biāo)

25、記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行WesternBlot分析。結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白可被NY363兔抗特異性識(shí)別，N51FdFc目的蛋白得到了正確表達(dá)。
　　 取10μg/ml的包被濃度進(jìn)行N51FdFc重組蛋白的ELISA檢測(cè)。從各組的數(shù)值來(lái)看，相同濃度下陽(yáng)性對(duì)照和樣品的吸收值接近。因此初步確定目的蛋白在真核細(xì)胞中得到了正確的表達(dá)。
　　 2).圓二色譜法分析N51FdFc蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)
　　 我們采用圓二色譜法檢測(cè)

26、了N51FdFc蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明單獨(dú)的N51FdFc蛋白顯示了復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但當(dāng)N51FdFc蛋白與C34孵育后形成了α-helicity結(jié)構(gòu)。與N51FdFc-ⅢB和N51FdFc-AE蛋白相比，N51FdFc-BC蛋白更易于和C34多肽相互作用，形成α-helicity結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng)。
　　 3).N51FdFc融合蛋白抑制了H9/HIV-1ⅢB細(xì)胞與MT-2細(xì)胞的早期進(jìn)入
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示N51FdF

27、c-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白可顯著阻止HIV病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，其IC50分別是95nM，66nM，78nM。抑制活性接近T20(P＜0.05)。
　　 4).N51FdFc融合蛋白能中和HIV-1ⅢB和Bal活病毒
　　 在HIV-1ⅢB中和試驗(yàn)中，N51FdFc-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白能抑制p24抗原表達(dá)，其IC50分別為152nM，93nM和97nM，抑

28、制活性接近T20(P＜0.05)。N51FdFc-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白對(duì)HIV-1Bal毒株的IC50分別為143nM，76nM和84nM，抑制活性也接近T20(P＜0.05)。來(lái)源于BC亞型的N51FdFc融合蛋白抗HIV活性最強(qiáng)。
　　 此外，我們挑選BC亞型的N51FdFc融合蛋白作為抗原，按照N63Fc融合蛋白免疫實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示小鼠抗血清沒(méi)有中和活性。
　　

29、 結(jié)論:
　　 以往的研究結(jié)果表明HIV-1gp41的NHR是弱免疫原，而且其抑制HIV感染的活性比衍生于gp41CHR的多肽低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因?yàn)橛坞x的衍生于gp41NHR的N多肽會(huì)聚集，因而不能形成穩(wěn)定的三聚體構(gòu)象。
　　 1.本文對(duì)源于gp41NHR結(jié)構(gòu)域的N63多肽及N51進(jìn)行改造，使之與人Fc片段
　　 或再與噬菌體Fd片段融合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些設(shè)計(jì)融合蛋白能維持三聚體構(gòu)象，具有比容易N-多肽更強(qiáng)的抗HIV活