大腸桿菌體內(nèi)和體外表達HIV-1 gp41重組抗原及其免疫反應性檢測.pdf

1、近年來，HIV病毒在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)快速流行態(tài)勢。HIV抗體診斷試劑作為目前初步診斷HIV的主要方法，具有巨大的市場價值。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程的手段，制備具有良好免疫反應性的HIV-1 gp41重組抗原原料，對于HIV抗體診斷試劑的研發(fā)有著深遠意義。
　　本文首先合成了經(jīng)過密碼子優(yōu)化的gp41基因質(zhì)粒模板pET-28a(+)-gp41，PCR擴增獲得了包含gp41主要優(yōu)勢抗原表位以及膜外重要結(jié)構(gòu)域(NHR、CHR、MPE

2、R)的截短基因序列。通過在gp41截短片段上游添加親水性分子伴侶DsbA，在大腸桿菌體內(nèi)實現(xiàn)了gp41優(yōu)勢抗原表位蛋白的融合表達。在優(yōu)化表達條件下（37℃，0.2 mM IPTG，誘導后培養(yǎng)時間10h），融合蛋白表達水平為8.7μg/mL。
　　鑒于gp41融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)表達的水平較低，無法滿足制備gp41抗原的要求，本研究進而利用大腸桿菌體外無細胞體系表達gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全長基因，成功構(gòu)建無細胞表達重

3、組質(zhì)粒pIVEX2.4c-gp41，在大腸桿菌無細胞體系中實現(xiàn)了gp41全長蛋白的表達。進一步考察去污劑重懸目標蛋白和直接在無細胞體系中添加去污劑兩種模式對獲得可溶gp41蛋白的影響。結(jié)果顯示，所嘗試的各種去污劑均不能有效重懸gp41蛋白沉淀;而直接添加去污劑模式在最優(yōu)條件下（添加終濃度為0.2％的Brij78），可溶gp41蛋白的表達水平達到650μg/mL。
　　對添加去污劑模式所表達的可溶gp41重組蛋白進行純化、濃縮和替換

4、緩沖液，蛋白純度達到95.6％，濃度為1.5 mg/mL，總回收率為70％。利用純化后的gp41重組蛋白制備乳膠法免疫層析試紙，通過對不同抗體滴度HIV-1陽性標本、HIV-1陰性標本、TP陽性標本以及HBeAb陽性標本的檢測，證明該gp41重組蛋白免疫反應性良好。
　　總之，本文致力于HIV-1 gp41在大腸桿菌體內(nèi)和體外無細胞體系的重組表達研究。通過對無細胞表達體系的優(yōu)化，實現(xiàn)了gp41的全長可溶表達，親和純化獲得的目標蛋白