體內和體外高效表達大腸桿菌水通道蛋白Z.pdf

1、大腸桿菌水通道蛋白Z(AqpZ)水選擇專一性強、滲透性高、結構穩(wěn)定，所以AqpZ在仿生廢水回收以及海水淡化等領域具有潛在的重要應用價值。但是由于AqpZ強烈疏水性會導致細胞毒性，使得在傳統(tǒng)大腸桿菌體系表達量僅僅只有2.5 mg/l，很難滿足制備基于水通道蛋白的水過濾裝置的需求。
　　 本工作的目的是運用融合表達策略和無細胞體系表達策略，高效制備功能性AqpZ，為制備新型水過濾裝置奠定堅實的基礎，并發(fā)展一個具有普遍意義的膜蛋白高效

2、表達技術。
　　 首先采用融合表達策略，即在目標膜蛋白的上游引入親水性分子伴侶，構建帶有不同融合標簽的體內表達載體。發(fā)現(xiàn)pMAL-P2-AqpZ對宿主細胞生長的影響最小，融合蛋白的表達水平最高，進一步優(yōu)化誘導條件(包括誘導時間、培養(yǎng)溫度、IPTG濃度、誘導后培養(yǎng)時間)，表達量可高達200 mg/l。
　　 由于AqpZ疏水性會導致細胞毒性，隨后采用沒有生長要求的無細胞蛋白質合成體系。構建的一系列帶有不同N端序列的無細胞體

3、系表達載體中，pIVEX2.4c-AqpZ為最佳表達載體。由于無細胞體系缺少膜蛋白正確折疊所需要的疏水環(huán)境，AqpZ都是以沉淀的形式表達。首先采用去污劑重懸的模式來制備可溶性AqpZ，然而采用的10余種去污劑均不能有效溶解AqpZ沉淀?？紤]到無細胞體系的開放性特點，采用直接添加去污劑的模式，發(fā)現(xiàn)Brij78為最優(yōu)去污劑，在112xCMC最佳工作濃度下，可溶表達水平約為530 mg/l。此外，還研究了直接添加脂質體的模式，在實驗最高脂質體

4、濃度(5 mg/ml)下，整合到磷脂膜的AqpZ表達水平達到470 mg/l。
　　 在無細胞體系表達AqpZ時發(fā)現(xiàn)，mRNA翻譯起始區(qū)形成二級結構會抑制翻譯的有效啟動，使得不帶有N端標簽的AqpZ表達量較低，所以開展了無細胞體系高效表達AqpZ新策略方面的研究。首先采用雙順反子策略，雖然構建的雙順反子質粒能夠有效提高AqpZ在大腸桿菌體系的表達水平，但這些質粒并不能在無細胞體系實現(xiàn)高效表達。隨后采用信號肽策略，構建帶有不同信號