小鼠乳鐵蛋白cDNA克隆及其大腸桿菌和酵母表達(dá).pdf

1、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，廣泛存在于乳汁、唾液、眼淚等分泌物中。乳鐵蛋白除鐵結(jié)合活性外還具有多種生物學(xué)功能，包括抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)、基因轉(zhuǎn)錄活化等功能，自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就一直是世界各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究克隆了昆明種小鼠乳鐵蛋白cDNA，分別構(gòu)建了原核、真核表達(dá)載體，并完成其在大腸桿菌和畢赤酵母中的重組表達(dá)，對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)定，為乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究及其進(jìn)一步規(guī)

2、?；a(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)從昆明種泌乳期小鼠乳腺組織中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR得到小鼠乳鐵蛋白cDNA全序列，該序列全長(zhǎng)2121bp，編碼一條707個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，其中前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，并對(duì)得到的小鼠乳鐵蛋白信號(hào)肽和成熟肽序列與其它10種哺乳動(dòng)物進(jìn)行對(duì)比，同源性都為50％以上，得到的小鼠成熟乳鐵蛋白與家鼠只存在6個(gè)氨基酸的差異，即Arg6，Met63，Ser359，Ala381，Glu420，Ala615

3、。 本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了小鼠乳鐵蛋白全序列（MLF）及其N(xiāo)-葉（MLFN）大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-MLF和pET28a-MLFN，實(shí)現(xiàn)了MLF及MLFN在大腸桿菌BI21（DE3）中的表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，分子量分別為81.73kDa和38.72kDa；變性條件下Ni2+親和層析柱純化目的蛋白，rMLF（重組MLF）和rMLFN（重組MLFN）的表達(dá)量分別為17

4、mg/L和20mg/L；包涵體體外復(fù)性產(chǎn)量分別為0.06mg/L和0.09mg/L；體外抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與陰性對(duì)照（dH2O，1.4×107 CFUs/ml）相比，在rMLFN的處理濃度為25μmol/L時(shí)，金黃色葡萄球菌的存活率有所下降（7.2×106 CFUs/ml），而12.5μmol/L的rMLF對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎沒(méi)有抑制作用。 進(jìn)一步將小鼠乳鐵蛋白N-葉基因克隆到酵母表達(dá)載體pPICZ

5、aA中，得到pPICZaA-MLFN；在此基礎(chǔ)上，體外構(gòu)建了小鼠乳鐵蛋白N-葉2～8拷貝酵母表達(dá)載體；將pPICZaA-MLFN轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33并誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot均檢測(cè)到39.6kDa外源蛋白的表達(dá)，0.5％甲醇誘導(dǎo)48h后，表達(dá)量最高；Ni2+親和層析柱純化產(chǎn)物，目的蛋白的得率為5mg/L；鐵結(jié)合活性分析表明rMLFN具有pH值依賴(lài)性的鐵離子結(jié)合/釋放能力，隨著pH值的下降，鐵飽和度也逐漸減小。