SARS-CoV S蛋白在裂殖酵母和大腸桿菌中的表達研究.pdf

1、SARS-CoV的S蛋白是病毒的主要結構蛋白，在病毒與受體相互作用及誘導中和抗體中起著非常關鍵的作用，是SARS疫苗的主要靶點。 裂殖酵母具有許多與高等真核生物相似的性質，不僅是分子生物學研究中很好的真核模型，也是一種非常有前景的外源基因表達系統(tǒng)，表達的外源蛋白更接近其天然特性。 為了SARS疫苗和SARS-CoV的生物特性的研究，根據(jù)預測的抗原表位分析，從含S基因全長的質粒上PCR擴增出含S蛋白預測主要抗原表位的5個片

2、段，分別位于S基因的nt43～903，808～1674，1591～2538，2440～3399，2734～3588。將這5個片段分別克隆到裂殖酵母載體pNMT1中構建了重組載體pNMT1-Sn(n=1，2，3，4，5)，并電轉化亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的裂殖酵母菌TCP1。重組的裂殖酵母菌株通過EMM選擇平板篩選并用PCR進一步鑒定。去硫胺可以誘導重組酵母菌的表達，誘導時間對表達量也有一定的影響。所有的重組蛋白表達分別用SDS-PAGE和Wes

3、ternblot檢測。 為了與裂殖酵母表達的外源蛋白加以比較，擴增出與S4對應的片段S4'，與大腸桿菌表達載體pET-22b連接，轉化大腸桿菌BL21。在重組大腸桿菌菌株培養(yǎng)基中添加一定濃度的IPTG誘導表達，并利用SDS-PAGE和Westernblot檢測了重組蛋白的表達。 SDS-PAGE結果表明，裂殖酵母重組菌中當去硫胺誘導16小時表達量達到最高，誘導時間延長表達量反而降低。S1和S5片段在約30kD處有明顯表達

4、，Westernblot也證實了這兩個片段有約30kD的表達，最高表達量占總酵母蛋白的10％以上。Westernblot也檢測到了其它三個片段的表達，其中S2片段大小為約34kD，S3和S4片段大小為約39kD。S2與S1和S5片段的大小相當，但是表達的重組蛋白要小4kD，可能是因為表達的重組蛋白有不同程度的糖基化。 大腸桿菌中表達的S4'片段SDS-PAGE和Westernblot分析顯示表達的重組蛋白大小為31kD，與裂殖酵