SARS-CoV S蛋白在裂殖酵母和大腸桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、SARS-CoV的S蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒與受體相互作用及誘導(dǎo)中和抗體中起著非常關(guān)鍵的作用，是SARS疫苗的主要靶點(diǎn)。 裂殖酵母具有許多與高等真核生物相似的性質(zhì)，不僅是分子生物學(xué)研究中很好的真核模型，也是一種非常有前景的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的外源蛋白更接近其天然特性。 為了SARS疫苗和SARS-CoV的生物特性的研究，根據(jù)預(yù)測(cè)的抗原表位分析，從含S基因全長(zhǎng)的質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增出含S蛋白預(yù)測(cè)主要抗原表位的5個(gè)片

2、段，分別位于S基因的nt43～903，808～1674，1591～2538，2440～3399，2734～3588。將這5個(gè)片段分別克隆到裂殖酵母載體pNMT1中構(gòu)建了重組載體pNMT1-Sn(n=1，2，3，4，5)，并電轉(zhuǎn)化亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的裂殖酵母菌TCP1。重組的裂殖酵母菌株通過EMM選擇平板篩選并用PCR進(jìn)一步鑒定。去硫胺可以誘導(dǎo)重組酵母菌的表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)量也有一定的影響。所有的重組蛋白表達(dá)分別用SDS-PAGE和Wes

3、ternblot檢測(cè)。 為了與裂殖酵母表達(dá)的外源蛋白加以比較，擴(kuò)增出與S4對(duì)應(yīng)的片段S4'，與大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。在重組大腸桿菌菌株培養(yǎng)基中添加一定濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并利用SDS-PAGE和Westernblot檢測(cè)了重組蛋白的表達(dá)。 SDS-PAGE結(jié)果表明，裂殖酵母重組菌中當(dāng)去硫胺誘導(dǎo)16小時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量反而降低。S1和S5片段在約30kD處有明顯表達(dá)

4、，Westernblot也證實(shí)了這兩個(gè)片段有約30kD的表達(dá)，最高表達(dá)量占總酵母蛋白的10％以上。Westernblot也檢測(cè)到了其它三個(gè)片段的表達(dá)，其中S2片段大小為約34kD，S3和S4片段大小為約39kD。S2與S1和S5片段的大小相當(dāng)，但是表達(dá)的重組蛋白要小4kD，可能是因?yàn)楸磉_(dá)的重組蛋白有不同程度的糖基化。 大腸桿菌中表達(dá)的S4'片段SDS-PAGE和Westernblot分析顯示表達(dá)的重組蛋白大小為31kD，與裂殖酵