SARS-COV的S蛋白引起急性肺損傷可能的免疫機制研究.pdf

1、目的：本研究將SARS-COV的S蛋白及STAT1抑制劑作用于宿主細(xì)胞及動物，觀察其發(fā)生的免疫和病理變化，了解其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，試圖揭示S蛋白引起急性肺損傷的可能機制。 研究內(nèi)容和方法： 一、研究SARS-COV的S蛋白對離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及趨化因子的影響 1、采用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SARS-COY全長重組S蛋白，并經(jīng)鎳親和磁珠法純化，WESTERN-BLOT鑒定。 2、原

2、代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)用膠原酶消化法獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定，用3-5代。 3、將不同濃度的S蛋白作用于原代培養(yǎng)的HUVEC，觀察其形態(tài)學(xué)變化并用液相芯片方法檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子及趨化因子的變化。 4、將S蛋白作用于人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，將新鮮分離的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)加入趨化小室上室，觀察16HBE產(chǎn)生的趨化因子對PBMCs的趨化作用。 二、研究SARS-COV的S蛋白誘導(dǎo)原

3、代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放gamma-干擾素可誘導(dǎo)的10Kda蛋白(IP-10)的信號分子機制 1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)。 2、WESTERN-BLOT及電泳遷移率分析(EMSA)檢測S蛋白對轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)活化的影響 3、RT-PCR及液相芯片方法檢測S蛋白對HUVEC的IP-10基因表達(dá)及蛋白合成釋放的影響，以及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)的活化在介導(dǎo)IP-

4、10表達(dá)中的地位。 4、STAT1抑制劑對S蛋白誘導(dǎo)的外周血單個核細(xì)胞趨化作用的影響。 三、探討SARS-COV的S蛋白誘導(dǎo)急性肺損傷的可能性以及IP-10的作用與地位；觀察STAT1抑制劑對急性肺損傷的影響。 1、BALB/C小鼠隨機分為PBS空白對照組、S蛋白組、S蛋白+STAT1抑制劑組(抑制劑組)和IP-10組，分別經(jīng)氣管滴注、尾靜脈注射的途徑注入，觀察其臨床癥狀、生存率。 2、分離小鼠雙肺稱取肺

5、濕重，并予以常規(guī)肺組織固定、包埋和切片，HE染色行病理學(xué)觀察。 3、免疫熒光方法檢測各組小鼠肺組織IP-10的表達(dá)。 結(jié)果： 一、SARS-COY的S蛋白作用于HUVEC形態(tài)學(xué)變化及產(chǎn)生細(xì)胞因子的特點： 1、S蛋白作用于HUVEC可引起細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞變圓有脫落，甚至隨時間延長細(xì)胞破碎溶解，陽性對照組γ-干擾素(IFN-γ)組也可見小部分細(xì)胞脫落但未見空泡變性，脫落程度較S蛋白組輕。 2、基礎(chǔ)

6、狀態(tài)下HUVEC并不生成IP-10，S蛋白作用12小時后即可見IP-10生成達(dá)(888.82±211.96)pg/ml，呈顯著量效反應(yīng)。但對其他參與免疫反應(yīng)的Th1/Th2細(xì)胞因子(包括IFN-γ)及趨化因子影響不明顯。而IFN-γ不僅能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IP-10的增高，而且能誘導(dǎo)其它因子的增高。 3、S蛋白刺激下的支氣管上皮細(xì)胞對PBMCs產(chǎn)生募集作用，該趨化作用通過加入人IP-10中和抗體可被阻斷。 二、SARS-COV

7、的S蛋白誘導(dǎo)HUVECIP-10表達(dá)可能的信號分子機制 1、基因芯片結(jié)果提示：S蛋白誘導(dǎo)了IFN-γ可誘導(dǎo)的信號通路相關(guān)基因的表達(dá) 2、WESTERN-BLOT方法結(jié)果表明：S蛋白作用于HUVEC誘導(dǎo)了STAT1的磷酸化。 3、EMSA結(jié)果證實：S蛋白作用于HUVEC，核蛋白可與ISRE和GASDNA基序結(jié)合。 4、RT-PCR及液相芯片結(jié)果證實：S蛋白誘導(dǎo)了HUVEC的IP-10基因表達(dá)及蛋白合成釋放；

8、STAT1抑制劑能夠從基因和蛋白水平完全阻斷S蛋白誘導(dǎo)HUVEC的IP-10表達(dá)。 5、STAT1抑制劑可以阻斷S蛋白誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞對外周血單個核細(xì)胞的趨化作用。 三、SARS-COV的S蛋白引起小鼠肺部的免疫損傷及STAT1抑制劑的作用 1、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白均可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)呼吸急促癥狀，甚至死亡。 2、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白的小鼠肺臟濕重增加，顯微鏡下可見肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)增厚

9、，炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹脫落。 3、經(jīng)氣管滴注小鼠IP-10蛋白小鼠出現(xiàn)上述類似的肺損傷表現(xiàn)。 4、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白的小鼠肺內(nèi)氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均強陽性表達(dá)IP-10。 5、STAT1抑制劑能夠減輕S蛋白引起的小鼠肺部病理損傷和臨床癥狀。 6、STAT1抑制劑可抑制S蛋白誘導(dǎo)小鼠肺內(nèi)IP-10表達(dá)。 結(jié)論： 1、SARS-COV可通過其S蛋白誘導(dǎo)血管