攜帶截短型SARS-CoV刺突蛋白S1亞單位重組腺病毒在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗SARS-CoV免疫反應(yīng)研究.pdf

1、研究背景和研究目的：嚴(yán)重急性的呼吸道綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)是一種由SARS病毒感染引起的突發(fā)性致命性疾病。發(fā)展有效而安全的SARS病毒疫苗是控制和預(yù)防SARS再次爆發(fā)的最好方法。SARS病毒滅活疫苗是最易制備的SARS疫苗，但滅活的全病毒疫苗存在著一些不安全的因素。研制SARS基因疫苗可能是一種更好的選擇。 S蛋白是SARS病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由S1和S2兩個(gè)亞單位

2、構(gòu)成。Sl負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，而S2介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合。采用可溶性SARS病毒受體或抗S1抗體均能通過(guò)干擾其與細(xì)胞受體的結(jié)合而阻斷病毒的有效感染。根據(jù)上述事實(shí)可以提出一個(gè)假設(shè)：如果設(shè)計(jì)一個(gè)疫苗干擾S蛋白與其受體的結(jié)合，那就可以阻止SARS病毒經(jīng)受體結(jié)合途徑傳播。非人類冠狀病毒疫苗的研究已證實(shí)冠狀病毒S1亞單位上存在誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位，它誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體能保護(hù)動(dòng)物免受相應(yīng)病毒的感染。最近關(guān)于SARS病毒疫苗的研究

3、也證實(shí)表達(dá)S蛋白或其S1亞單位的基因疫苗能在多種動(dòng)物模型中誘導(dǎo)高滴度的保護(hù)性中和抗體產(chǎn)生。然而Weingartl等報(bào)道用痘苗病毒表達(dá)全長(zhǎng)S蛋白可在雪貂體內(nèi)快速誘導(dǎo)出有效的中和抗體反應(yīng)，同時(shí)也增強(qiáng)了SARS病毒誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)。 在本研究中，我們構(gòu)建一個(gè)表達(dá)截短的S1亞單位片段(截短的S1亞單位，SN)的重組5型腺病毒Ad-S<,N>，研究其在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行初步的安全性研究，希望能為研制出一種安全、有

4、效的SARS病毒疫苗打好基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.重組腺病毒的構(gòu)建 通過(guò)PCR擴(kuò)增SARS病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike)N端基因片段(SN，-45nt～1469nt)。引物分別為5’-GGTCTAGAGTlTGTGGTTFCAAGTGAT-3’和5’-TAGGTACCAATGCCAGTAGTGGTG-3’。S<,N>片段通過(guò)．XbaI和KpnI位點(diǎn)克隆進(jìn)pShuttle質(zhì)粒得到pShuttle-S<

5、,N>。所得質(zhì)粒采用PCR、限制性酶切和測(cè)序分析進(jìn)行鑒定。 將pShuttle-S<,N>用I-CeuI和PI-SCeI酶切后，與pAdeno-X的I-CeuI/PI-SceI雙酶切片段直接連接，構(gòu)建含SN表達(dá)框的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-S<,N>。構(gòu)建產(chǎn)物采用PCR法初步鑒定后，再用限制性酶切分析和測(cè)序鑒定。將pAd-S<,N>用PacI酶切使重組腺病毒DNA線性化后轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞以獲得重組腺病毒Ad-S<,N>。重組腺病毒在

6、293細(xì)胞中擴(kuò)增，經(jīng)CsCl密度梯度離心純化后，采用Adeno-X<'TM>快速滴度測(cè)定試劑盒測(cè)定滴度。通過(guò)PCR檢測(cè)S<,N>表達(dá)框架、重組腺病毒骨架(E2區(qū))對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)其中有無(wú)野生型腺病毒、無(wú)表達(dá)框架或無(wú)外源基因的重組腺病毒、腺相關(guān)病毒污染。通過(guò)限制性酶切分析鑒定Ad-S<,N>基因組的正確性。 Ad-Lacz和Ad-GFP分別為攜帶β-半乳糖苷酶基因和綠色熒光蛋白基因的重組5型腺病毒，是本實(shí)驗(yàn)室按照同樣方

7、法構(gòu)建的，在本研究中作為載體對(duì)照。 2.RT-PCR檢測(cè)S<,N>基因表達(dá) 用TRIZOL試劑抽提重組腺病毒感染的Vero-E6細(xì)胞或大鼠組織中的RNA，用無(wú)Rnase的DNase去除殘留的DNA后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用SN特異的引物(5’-CGAGTACATATCTGATGCC-3’和5’-ACGCCATAGCACTTAAAGG-3’)進(jìn)行PCR檢測(cè)S<,N> mRNA水平的表達(dá)，內(nèi)對(duì)照采用β-actin引物(

8、5’-CGTCTCCCCTCCATCGTG-3’和5’-CCCTCATAGATGGGCACAG-3’)。 3.Western blot分析 為了檢測(cè)S<,N>的表達(dá)及S<,N>與SARS患者血清和免疫大鼠抗血清的特異性結(jié)合反應(yīng)，我們采用三種一抗：兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康復(fù)期血清、免疫大鼠血清進(jìn)行了Western blot分析。細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清和大鼠組織勻漿液用10﹪ SDS-PAGE分離

9、、轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；PVDF膜封閉過(guò)夜后，依次與一抗(兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康復(fù)期血清、免疫大鼠血清)、二抗(HRP偶聯(lián)的抗兔/人/大鼠IgG抗體)雜交，用LumiGLO<'TM>顯色液顯色(化學(xué)發(fā)光)，X光片曝光顯影。 4.免疫大鼠 Wistar大鼠(每組10只)分別用Ad-S<,N>(1×10<'7>pfu/(dose·rat))或?qū)φ?Ad-LacZ或PBS)通過(guò)鼻腔(i.n.)或皮下(S.C.

10、)免疫大鼠，大鼠分別于第0、7、14天各免疫一次，于第0、7、14和21天通過(guò)眼窩靜脈叢取血；第28天從腹主靜脈取血，并處死動(dòng)物，取各主要組織和器官。 5.抗SARS-CoV抗體檢測(cè) 抗SARS-CoV IgG滴度用ELIsA法測(cè)定。SARS-CoV全抗原包被的96孔酶標(biāo)板依次用2倍系列稀釋的大鼠血清、HRP偶聯(lián)的抗大鼠IgG抗體(二抗)孵育，加底物液顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)450nm吸光度OD<,450nm>(630nm作為對(duì)

11、照波長(zhǎng))；OD<,450nm>值高于陰性對(duì)照0.16的孔定位陽(yáng)性，樣品陽(yáng)性孔最高稀釋度為抗體的滴度。 6.抗SARS-CoV中和抗體檢測(cè) 免疫大鼠血清中和抗體活性用體外微孔中和分析法測(cè)定。2倍系列稀釋的熱滅活大鼠血清與100TCID50的SARS病毒混合后溫育1h后，加入種有Vero．E6細(xì)胞的96孔板中37℃培養(yǎng)3～4天，觀察細(xì)胞病變情況；每組實(shí)驗(yàn)孔中60﹪以上(即5復(fù)孔中至少3個(gè)孔)細(xì)胞不出現(xiàn)病變的血清最高稀釋度為該

12、樣品的中和抗體滴度。 7.大鼠CTL活性檢測(cè) 免疫大鼠脾細(xì)胞勻漿、過(guò)濾、梯度離心、過(guò)尼龍毛柱獲得大鼠T細(xì)胞，用SARS病毒S蛋白抗原肽庫(kù)刺激48h后作為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞為大鼠肝細(xì)胞BRL-pcDNA3.1(S<'->)和BRL-sarsS(S<'+>)，用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)大鼠T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、體積校正對(duì)照孔、培養(yǎng)基背景孔等對(duì)照。測(cè)量490nm處的光吸收(OD

13、)值，按以下公式計(jì)算殺傷活性。殺傷活性(﹪)=[(OD<,殺傷孔>-OD<,培養(yǎng)基背景>)-(OD<,效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)-(OD<,靶細(xì)胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)]/[(OD<,靶細(xì)胞最大釋放>-OD體積校正)-(OD<,靶細(xì)胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)]×100 8.實(shí)驗(yàn)大鼠組織學(xué)檢查 免疫大鼠于第28天處死，取各種主要臟器和組織(肺、肝、結(jié)腸、心臟、腦組織、脾臟、腎臟等)，用