SARS-CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高量表達(dá)純化及功能研究.pdf

1、導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)世界性爆發(fā)流行的病原體是一種新型的冠狀病毒SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。SARS是一種以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的全身性疾病，可引起全身多器官多組織損傷，導(dǎo)致患者死亡的主要病因?yàn)榧毙院粑狡染C合征(ARDS)。其宿主范圍廣，傳播速度快，且可通過(guò)飛沫甚至空氣傳播，危害極大。 現(xiàn)有研究證實(shí)，SARS-CoV的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)是病毒表面的最重要的膜蛋白，能夠與受體結(jié)

2、合并促進(jìn)病毒入胞，并且是誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白。但由于S蛋白存在大量的翻譯后修飾位點(diǎn)，主要是糖基化位點(diǎn)，致使通過(guò)原核細(xì)胞表達(dá)或酵母表達(dá)的蛋白將不能正確地折疊，影響其生物活性。只有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，S蛋白才能進(jìn)行正確地修飾，折疊和加工處理，從而保持蛋白的活性。但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)SARS-CoV編碼的S蛋白又存在表達(dá)量低的特點(diǎn)，難以在實(shí)際中應(yīng)用。因此，本論文通過(guò)一系列的優(yōu)化與實(shí)驗(yàn)，將全長(zhǎng)的S蛋白及其不

3、同的片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行了高量表達(dá)及純化。并進(jìn)一步研究了S蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)作用。本論文的一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明S蛋白能夠結(jié)合宿主細(xì)胞受體，并引起受體下調(diào)，從而造成或加劇急性肺損傷，從分子水平上解釋了SARS是如何導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征的致病機(jī)理。本論文還進(jìn)一步驗(yàn)證了S蛋白結(jié)合受體的部位為第318位到510位氨基酸，這一區(qū)域同樣引起受體下調(diào)，造成或加劇急性肺損傷，從而提出了研發(fā)安全的SARS疫苗需要對(duì)S蛋白進(jìn)行突變或修飾，尤其是對(duì)

4、S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸進(jìn)行突變與修飾，使其不能結(jié)合或降低與ACE2受體結(jié)合能力，這是制備高效安全的抗SARS-CoV病毒疫苗的關(guān)鍵。 本論文通過(guò)實(shí)現(xiàn)S蛋白及其不同片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中高量表達(dá)及純化，使S蛋白及其片段的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，從而為SARS-CoV基因工程重組疫苗的規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供可能。建立綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的以維甲酸受體為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型建立綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的以維甲

5、酸受體為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型，可用于篩選治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)、銀屑病、痤瘡以及腫瘤的新型藥物，具有很大的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。 根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，選擇能夠高效與維甲酸受體結(jié)合并刺激基因表達(dá)的DNA應(yīng)答兀件RARE序列，加入相應(yīng)酶切位點(diǎn)修飾后進(jìn)行人工合成，用分子生物學(xué)的方法，構(gòu)建含有多個(gè)串連維甲酸受體應(yīng)答元件(RARE)及報(bào)告基因E-GFP的重組載體。用大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增和大量提取后，將含有維甲酸受體的體外培

6、養(yǎng)的細(xì)胞株用該重組載體進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，用選擇性藥物進(jìn)行篩選后，用有限稀釋法選取單克隆細(xì)胞，在細(xì)胞由單克隆分裂至一定程度后，將獲得的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行單一性、敏感性的篩查，最終挑選出敏感、高效、穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞，凍存及擴(kuò)增后，用于篩選針對(duì)維甲酸受體的小分子有機(jī)藥物。 通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，利用本論文中所述的方法，最終建立了高效的藥物篩選細(xì)胞模型。本論文利用建成的細(xì)胞模型進(jìn)行初篩，篩選出了6種能夠結(jié)合維甲酸受體的化合物。 本論文的