SARS-CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳動物細胞中的高量表達純化及功能研究.pdf

1、導(dǎo)致嚴重急性呼吸綜合征(SARS)世界性爆發(fā)流行的病原體是一種新型的冠狀病毒SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。SARS是一種以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的全身性疾病，可引起全身多器官多組織損傷，導(dǎo)致患者死亡的主要病因為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。其宿主范圍廣，傳播速度快，且可通過飛沫甚至空氣傳播，危害極大。 現(xiàn)有研究證實，SARS-CoV的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)是病毒表面的最重要的膜蛋白，能夠與受體結(jié)

2、合并促進病毒入胞，并且是誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白。但由于S蛋白存在大量的翻譯后修飾位點，主要是糖基化位點，致使通過原核細胞表達或酵母表達的蛋白將不能正確地折疊，影響其生物活性。只有在哺乳動物細胞系統(tǒng)中進行表達，S蛋白才能進行正確地修飾，折疊和加工處理，從而保持蛋白的活性。但在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達SARS-CoV編碼的S蛋白又存在表達量低的特點，難以在實際中應(yīng)用。因此，本論文通過一系列的優(yōu)化與實驗，將全長的S蛋白及其不

3、同的片段在哺乳動物細胞系統(tǒng)中進行了高量表達及純化。并進一步研究了S蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)作用。本論文的一系列的實驗結(jié)果證明S蛋白能夠結(jié)合宿主細胞受體，并引起受體下調(diào)，從而造成或加劇急性肺損傷，從分子水平上解釋了SARS是如何導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征的致病機理。本論文還進一步驗證了S蛋白結(jié)合受體的部位為第318位到510位氨基酸，這一區(qū)域同樣引起受體下調(diào)，造成或加劇急性肺損傷，從而提出了研發(fā)安全的SARS疫苗需要對S蛋白進行突變或修飾，尤其是對

4、S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸進行突變與修飾，使其不能結(jié)合或降低與ACE2受體結(jié)合能力，這是制備高效安全的抗SARS-CoV病毒疫苗的關(guān)鍵。 本論文通過實現(xiàn)S蛋白及其不同片段在哺乳動物細胞系統(tǒng)中高量表達及純化，使S蛋白及其片段的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，從而為SARS-CoV基因工程重組疫苗的規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供可能。建立綠色熒光蛋白(GFP)標記的以維甲酸受體為靶點的高通量藥物篩選細胞模型建立綠色熒光蛋白(GFP)標記的以維甲

5、酸受體為靶點的高通量藥物篩選細胞模型，可用于篩選治療急性早幼粒細胞白血病(APL)、銀屑病、痤瘡以及腫瘤的新型藥物，具有很大的應(yīng)用前景和市場價值。 根據(jù)已發(fā)表的文獻，選擇能夠高效與維甲酸受體結(jié)合并刺激基因表達的DNA應(yīng)答兀件RARE序列，加入相應(yīng)酶切位點修飾后進行人工合成，用分子生物學(xué)的方法，構(gòu)建含有多個串連維甲酸受體應(yīng)答元件(RARE)及報告基因E-GFP的重組載體。用大腸桿菌進行質(zhì)粒擴增和大量提取后，將含有維甲酸受體的體外培

6、養(yǎng)的細胞株用該重組載體進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，用選擇性藥物進行篩選后，用有限稀釋法選取單克隆細胞，在細胞由單克隆分裂至一定程度后，將獲得的單克隆細胞株進行單一性、敏感性的篩查，最終挑選出敏感、高效、穩(wěn)定表達的單克隆細胞，凍存及擴增后，用于篩選針對維甲酸受體的小分子有機藥物。 通過一系列實驗，利用本論文中所述的方法，最終建立了高效的藥物篩選細胞模型。本論文利用建成的細胞模型進行初篩，篩選出了6種能夠結(jié)合維甲酸受體的化合物。 本論文的