Kallistatin蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)、純化及單克隆抗體制作初探.pdf

1、學(xué)校代碼：10385分類號(hào)：研究生學(xué)號(hào)：密級(jí)：KallistatinKallistatin蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)、純化及單克隆抗體制作初探蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)、純化及單克隆抗體制作初探PreliminaryStudyonMammalKallistatinproteinexpression，purificationmonoclonalantibodyproduction作者姓名：孫丹丹孫丹丹指導(dǎo)教師：許瑞安許瑞安合作教師：學(xué)科：生物學(xué)（生物化學(xué)

2、與分子生物學(xué)）生物學(xué)（生物化學(xué)與分子生物學(xué)）研究方向：臨床診斷試劑盒的研發(fā)臨床診斷試劑盒的研發(fā)所在學(xué)院：生物生物醫(yī)學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)學(xué)院論文提交日期：二零二零一六年一六年三月二十八二十八日摘要I摘要人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白（Kallistatin，Kal），作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在炎癥反應(yīng)、血管生成以及損傷修復(fù)等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本課題組前期研究表明，Kal具有良好的抗肝纖維化的作用，可以抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的活化，下調(diào)

3、星狀細(xì)胞中的α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)的表達(dá)，并且抑制H202誘導(dǎo)的星狀細(xì)胞活性氧的形成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Kal可以作為肝纖維化診斷指標(biāo)來(lái)對(duì)肝臟健康狀況進(jìn)行有效檢測(cè)，并申報(bào)國(guó)家專利。本研究是在Kal確定可以作為肝纖維化診斷試劑研發(fā)基礎(chǔ)上的自然延伸，旨在創(chuàng)建一個(gè)以Kallistatin為指標(biāo)的肝纖維化分子診斷ELISA試劑盒。本研究根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部關(guān)于臨床診斷試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)計(jì)、推進(jìn)。即當(dāng)前臨床上所用試劑盒除了對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)外的試劑盒均為是使用

4、雙抗體夾心法，在檢測(cè)抗體上加入生物素鏈霉親合素系統(tǒng)。本研究首先采用畢赤酵母發(fā)酵法和哺乳動(dòng)物表達(dá)獲取Kal蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：畢赤酵母表達(dá)的Kal蛋白糖基化水平不足，與天然的蛋白質(zhì)有一定的差異，無(wú)法采用。故本研究采用酵母發(fā)酵和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)獲得的Kal蛋白進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果顯示：通過(guò)酵母發(fā)酵可獲得較高純度的重組Kal蛋白，使用該蛋白制作抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)其Kal蛋白免疫原性較差，所以進(jìn)行免疫時(shí)使用40μgmL的Kal與弗氏佐劑1:1混合后