間日瘧原蟲乳酸脫氫酶的表達(dá)、純化及單克隆抗體的制備.pdf

1、瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶一些發(fā)展中國家，同樣也是對我國人民健康危害最嚴(yán)重的傳染病之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球每年有近3-5億人感染瘧疾，其中約300萬人死亡[1]。從近幾年我國瘧疾報告情況看，在26種甲、乙類法定報告?zhèn)魅静≈?，瘧疾發(fā)病數(shù)始終處于第9位，死亡率排在12～14位，病死率排在12～17位不等；在自然疫源性及蟲媒傳染病中，瘧疾報告發(fā)病數(shù)僅次于流行性出血熱而始終居于第2位，占自然疫源性及蟲媒傳染病報告

2、總數(shù)的28.25％～32.62％[2]。因此，瘧疾的快速診斷在其防治工作中就顯得格外重要。 目前的瘧疾診斷方法主要有：1)以鏡檢為基礎(chǔ)。如傳統(tǒng)的厚，薄血膜法[3]；QBC法[4-7]等；2)免疫學(xué)診斷方法。如間接熒光抗體實驗(IFAT)，ParaSight-F法[8-9]，ICT法，DipstickOpitMAL法；3)分子生物學(xué)方法。如DNA探針檢測(同位素或非同位素標(biāo)記)，PCR法。QBC法及Kawamoto法[10-12]

3、雖然敏感性比血涂片鏡檢法提高了8倍以上，特異性達(dá)98.4％，但其所使用的毛細(xì)管價格昂貴(每支0.8美元)，又不能重復(fù)使用，操作上也較繁瑣，且難以有效地進(jìn)行蟲株鑒別及蟲體計數(shù)，因此難以在基層推廣應(yīng)用。八十年代以來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的基因診斷技術(shù)(分子雜交[3-14]，PCR[15-16]、套式PCR[17-18]、熒光定量PCR[19]等)，顯示了較高的敏感性和特異性，且能對瘧原蟲的感染作出早期快速的診斷，但也存在著需要特殊儀器設(shè)

4、備和反應(yīng)試劑較昂貴的問題。 以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測，特別是近幾年來以單抗為基礎(chǔ)的Dipstick技術(shù)，由于其操作簡便、快速，結(jié)果易于判定，在瘧疾診斷上日漸受到重視并展示了廣闊的應(yīng)用前景[20-21]。該技術(shù)主要是利用單克隆抗體檢測瘧原蟲的特異性抗原，即抗原捕獲法檢測。該法從取血、反應(yīng)、結(jié)果判斷，只需5～10分鐘，而且多個樣本可同時進(jìn)行檢測，不需特殊儀器，非常適合于基層醫(yī)院和防疫部門使用[20]。目前美國、澳大利亞等已開發(fā)出P

5、araSight-F(BectonDickinsort，Cockeysoville，Maryland，USA)、ICTMalaria.P.f和ICTMalariaP.f/P.v(ICTDiagnostics，Sydney，Australia)、OptiMAL(FlowInc，PortlandOreg)等快速免疫診斷試劑盒，現(xiàn)場評估均取得較好的效果。但這些試劑盒價格昂貴，且均存在一定的局限性，因而有必要尋找一種更具有診斷價值的新型靶抗原。

6、 本課題是基于瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDHp)同宿主動物L(fēng)DH在理化、免疫學(xué)特性和酶學(xué)方面有很大的差異的基礎(chǔ)上設(shè)計的。在催化乳酸生成丙酮酸反應(yīng)中，LDHp能夠迅速地利用NAD類似物3'-乙酰吡啶NAD(APAD)作為輔酶，而紅細(xì)胞LDH(LDHr)在APAD存在時參與這一反應(yīng)速率很慢[22-23]；另外，LDHp具有種、屬特異性，因而是檢測瘧原蟲理想的靶抗原。由于LDHp僅由活蟲體產(chǎn)生，血液中LDHp的水平與蟲體血癥呈平行相關(guān)，因此

7、利用LDHp來檢測還能鑒別蟲體的死亡，由此可以鑒定瘧原蟲克隆株、監(jiān)測藥物的療效及復(fù)燃情況。 相比最早應(yīng)用在瘧疾快速診斷(Malariarapiddiagnostictests，RDTs)中的富組氨酸蛋白-2(HRP-2)，LDH具有更好的診斷特異性，因為在瘧疾得到治療后，其pLDH能快速從血液中清除，從而避免因循環(huán)抗原的長期存在所造成的假陽性而導(dǎo)致濫用藥物，因此也更能適應(yīng)大規(guī)模流行區(qū)域的需要[24]。 本研究的最終目標(biāo)是

8、建立以LDH為診斷靶分子的免疫層析技術(shù)，使其能對間日瘧原蟲進(jìn)行特異性診斷，同時能鑒別診斷惡性瘧原蟲。先前本實驗室已經(jīng)成功制備惡性瘧原蟲單克隆抗體及初步建立了相應(yīng)的膠體金層析法[25-26]。因此本研究的關(guān)鍵是獲得能特異性針對間日瘧原蟲的單克隆抗體。但當(dāng)時由于間日瘧原蟲不能體外培養(yǎng)，且又尚未獲取間日瘧原蟲的LDH基因，故一直不能解決間日瘧原蟲抗原的來源問題。2004年BrownWM首先報道了SalvadorⅠ株LDH的部分基因序列，200

9、5年Turgut-BalikD報道了Belem株的LDH全基因序列。本研究根據(jù)間日瘧原蟲SalvadorⅠ株LDH的部分基因序列，成功克隆了PvLDH的部分基因，將其構(gòu)建成LDH/pGEX-4T-1表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。通過復(fù)性和柱層析技術(shù)純化融合蛋白，并采用雜交瘤技術(shù)制備了針對該蛋白的單克隆抗體，且對抗體進(jìn)行了初步鑒定。 結(jié)果顯示，利用PCR技術(shù)成功地釣取了編碼我國間日瘧原蟲云南株乳酸脫氫酶LDHpv的基因序列。將L

10、DHpv基因克隆到pGEX-4T-1表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定，篩選到pGEX-LDH重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中得到高效表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)蛋白質(zhì)分子量約為56kDa，與理論值相符。表達(dá)產(chǎn)物超聲破菌后進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。將包涵體洗滌溶解后，通過稀釋復(fù)性和透析復(fù)性兩張不同復(fù)性方法的比較，建立了以20mmol/LTris-HCl，1mmol/L，EDTA，1mm

11、ol/LGSSG，0.1mmol/LGSH，pH8.0的復(fù)性工藝，并利用GlutathioneSepharose4B親和層析柱純化，得到濃度為0.5mg/ml的蛋白溶液。用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，ELISA法測免疫血清效價為1:51200，Western-blotting結(jié)果顯示該血清能特異性地與間日瘧和惡性瘧患者全血抗原發(fā)生反應(yīng)，而不與正常人起交叉反應(yīng)，表明該蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。

12、 取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，融合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng)。采用用純化的pGEX-4T-1/LDH重組蛋白和純化的GST蛋白同時進(jìn)行篩選，篩選出只與pGEX-4T-1/LDH反應(yīng)(OD4.50>0.6)，而不與GST蛋白反應(yīng)(OD450<0.1)的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過3-4次亞克隆后獲得分泌穩(wěn)定的高效價和高特異性的抗LDH重組蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞5株，分別為6D1，6D2，5A10，5C7，4A8