Annexin A2單體(p36)的表達(dá)、純化及其單克隆抗體制備.pdf

1、目的：Annexins 是一類鈣依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白。Annexin A2 是Annexins家族中的一個重要成員，存在于細(xì)胞膜、胞質(zhì)和胞外。Annexin A2 蛋白在細(xì)胞膜構(gòu)架的形成、膜聚合、內(nèi)吞和胞吐中均扮演重要角色。Annexin A2 還參與某些病理過程，與心血管疾病、血液病、腫瘤等多種疾病相關(guān)。本室通過脊髓損傷動物模型、microarray、體外神經(jīng)元培養(yǎng)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)：Annexin A2 在脊髓損傷后表達(dá)增高，Annexin

2、 A2 蛋白對神經(jīng)損傷有明顯保護(hù)作用，提示Annexin A2 有望成為神經(jīng)損傷保護(hù)性藥物。本研究在原有工作基礎(chǔ)上，表達(dá)純化Annexin A2的單體――p36，并將純化后的p36 蛋白免疫小鼠，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)獲得抗p36單克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究Annexin A2的體內(nèi)外功能，以及開發(fā)相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)性藥物奠定良好基礎(chǔ)。 方法：1）抽提大鼠來源的總RNA,RT-PCR 擴(kuò)增p36 基因的全長序列，通過TA克隆接入pGEM-T

3、 質(zhì)粒，藍(lán)白板篩選后進(jìn)行測序鑒定。2）酶切獲得p36 基因全長序列，并將其接入pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成pET-28a－p36 表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至BL21 大腸桿菌，篩選、鑒定后，測序驗(yàn)證。3）采用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)p36 融合蛋白，利用融合蛋白N 端存在的6 個組氨酸標(biāo)簽，在變性條件下，通過Ni-NTA 柱純化p36 蛋白。4）將純化的p36 蛋白與佐劑充分乳化后免疫Balb/c小鼠，等小鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體后進(jìn)行雜交瘤融合，

4、并通過篩選獲得分泌抗p36 單抗的特異性細(xì)胞株。5）將篩選出的細(xì)胞株注入Balb/c小鼠腹腔，等產(chǎn)生腹水后收集腹水，并進(jìn)行抗體的純化和鑒定。 結(jié)果：1）克隆出大鼠p36 全長基因，成功構(gòu)建pET-28a-p36 表達(dá)質(zhì)粒,在BL21細(xì)菌中可成功誘導(dǎo)表達(dá)出p36 融合蛋白。2）獲得了純化的p36 融合蛋白。3）獲得了抗大鼠p36 特異性單克隆抗體,經(jīng)鑒定所得單抗可以和p36 蛋白特異結(jié)合。 結(jié)論：采用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的p