禽白血病病毒p27蛋白表達(dá)純化及其單克隆抗體的制備.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽反轉(zhuǎn)錄病毒(AvianLeukosis Virus，ALV)引起的一種禽類(lèi)多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱(chēng)。本病呈世界性分布，感染率高，能引起雞的死亡、消瘦，降低雞群的生產(chǎn)能力，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。本病歷史悠久又不斷出現(xiàn)新型病例，如，J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J，ALV—J)，是20世紀(jì)80年代末在英

2、國(guó)發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)新的禽白血病病毒亞群，對(duì)肉雞業(yè)造成了巨大的危害，在我國(guó)一些地區(qū)也有本病發(fā)病的報(bào)道。目前，對(duì)禽白血病尚無(wú)有效的藥物治療，也沒(méi)有疫苗可以進(jìn)行預(yù)防，世界各國(guó)主要通過(guò)病原檢測(cè)，淘汰陽(yáng)性雞，凈化種群等防制措施來(lái)控制本病。 p27蛋白是ALV核心衣殼蛋白的主要成分，是一種高度保守的非糖基化蛋白，有許多病毒抗原位點(diǎn)，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本研究目的是將含有p27重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21菌進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行原核表達(dá)條件優(yōu)化。

3、結(jié)果表明，最適表達(dá)條件為：37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6；加入IPTG濃度至1mmol/L，30℃振蕩(200rpm)培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)3h。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE檢測(cè)，在43KD處出現(xiàn)目的蛋白，光密度掃描分析重組蛋白占菌體總蛋白的19.83％。經(jīng)Western—blot檢測(cè)，表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性。對(duì)目的蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni—NTA純化樹(shù)脂對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，收集不同咪唑濃度緩沖液的洗脫液，經(jīng)SDS—PAG

4、E檢測(cè)，在GuNTA-60 Buffer和GuNTA-100 Buffer洗脫液中有目的蛋白存在。 以純化的p27蛋白為抗原免疫BALB/c純系小鼠，100μg/只，共免疫4次。采血，建立間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。取血清效價(jià)高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。用HAT選擇培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞集落布滿(mǎn)孔底1/2時(shí)，取上清作抗體活性檢測(cè)。采用有限稀釋法對(duì)

5、陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆，重復(fù)3次，得到兩株單克隆細(xì)胞株：2E8、3C6。及時(shí)凍存得到的單克隆細(xì)胞株，并進(jìn)行腹水制備，測(cè)定腹水效價(jià)在1：6400以上。采用硫酸銨沉淀法對(duì)單抗進(jìn)行純化，用紫外分光光度儀測(cè)定兩株純化后的單抗蛋白含量，根據(jù)公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度分別為4.3 mg/ml和4.6 mg/ml。經(jīng)SDS—PAGE和Western—blot檢測(cè)，所得單抗且有良好的特異性。 本研究的完成為今后制作抗p27單抗試劑盒商品化的研發(fā)，快速、準(zhǔn)確診