J亞群禽白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒單克隆抗體的研制.pdf

1、禽白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥均可引起禽類腫瘤和免疫抑制性疾病。這兩種禽腫瘤病都可導(dǎo)致不同程度的二重感染、多重感染及繼發(fā)感染，減弱雞群對各種疫苗的應(yīng)答能力，加劇某些疾病的臨床表現(xiàn)。目前，對禽白血病和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥尚無有效的藥物治療，也沒有疫苗可以進行預(yù)防，世界各國主要通過抗原/抗體檢測，淘汰陽性雞，凈化種群等防制措施來控制這兩種禽腫瘤病。ALV-J gp85基因編碼的表面蛋白（SU）是病毒囊膜蛋白的重要組成成分，有許多病毒抗原位點，

2、也是亞群區(qū)分的主要蛋白，是檢測亞群特異性抗體的首選抗原。REV env基因編碼SU和跨膜蛋白（TM）。本課題分別以ALV-J中國株WS0705 和REV原型株SNV株為標準株，選取了1200bp相對保守的env基因序列，包涵該段基因表達REV病毒90％以上的抗原位點，既保證了基因的保守性又保留了良好的抗原性。
　　 本研究將含有ALV-J gp85基因重組質(zhì)粒pProExHTB-gp85轉(zhuǎn)化入BL21宿主菌，將含有REV env

3、基因的重組質(zhì)粒pET-28a-env轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）宿主菌，分別優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，分別在在35KD處和45KD處出現(xiàn)目的蛋白。采用尿素法純化大量表達的蛋白包涵體，通過透析法恢復(fù)蛋白的天然構(gòu)象和蛋白活性。測定純化蛋白濃度后進行ELISA和Western-blot檢測，結(jié)果顯示ELISA檢測靈敏性能達到100ng/mL，表達的兩種蛋白都具有良好的靈敏性和特異性。以純化的His-gp85蛋白和His

4、-env蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，免疫劑量為300μg/只，免疫3次采后通過ELISA和IFA試驗測定了所獲得的多抗效價，ELISA測得效價分別達到1：100萬和1:200萬，IFA測得效價分別高于1:3200和1:12800。以純化的His-gp85蛋白和His-env蛋白為抗原免疫6周齡的Balb/c純系小鼠,40μg/只，免疫3次，采血，建立間接ELISA方法和IFA法測定血清抗體效價。取血清效價高的Balb/c小

5、鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在PEG1500的作用下進行細胞融合。用HAT選擇培養(yǎng)基對雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，當雜交瘤細胞集落布滿孔底1/4-1/2時，取細胞上清作抗體效價檢測。采用有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，重復(fù)3次以上，直到取得能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞株。得到抗ALV-J病毒單克隆細胞兩株分別命名為1D3和3B1，ELISA檢測細胞上清抗體效價均為1:1024；得到抗REV病毒單克隆細胞株一株命名為4D5，ELISA檢測細胞上清效