Anti-ECL1抗體阻斷J亞群禽白血病病毒感染及組織保護(hù)研究.pdf

1、鈉氫離子交換蛋白（NHE）是廣泛存在于細(xì)胞膜的跨膜蛋白，具有pHi調(diào)定點(diǎn)，決定胞內(nèi)pHi水平，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞行為調(diào)節(jié)的發(fā)生和發(fā)展以及組織損傷具有密切關(guān)系。NHE的9個(gè)同種型分別在不同的組織和細(xì)胞分布。NHE1是目前研究最為清楚的一個(gè)同種型，此外NHE1對(duì)組織損傷具有重要作用，尤其在心肌中。2006年雞的NHE1（chNHE1）被證明是ALV-J受體。J亞群禽白血病病毒（ALV-J）為RNA病毒，能夠引起組織損傷，生長(zhǎng)抑制，生產(chǎn)

2、性能下降及腫瘤，但由于自身的超突變性以及引起疾病的復(fù)雜性，至今未研究清楚其感染機(jī)制和有效的疫苗或者藥物，嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)。ALV-J的感染過(guò)程，首先由Env與受體chNHE1相互作用，進(jìn)而引起組織損傷和生產(chǎn)性能下降等各種癥狀。chNHE1與Env直接結(jié)合，隨后Env跨膜區(qū)（TM）構(gòu)象發(fā)生改變來(lái)促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合，該步驟是病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。chNHE1第一膜外環(huán)（ECL1）是最大膜外環(huán)，因此阻斷ECL1受體可能阻斷ALV-J的

3、感染，從而減輕機(jī)體的組織損傷程度。那么chNHE1對(duì)ALV-J誘導(dǎo)的組織損傷是否具有決定性作用？這一問(wèn)題值得深入探究。
　　本研究擬通過(guò)制備chNHE1第一膜外環(huán)抗體，檢測(cè)其阻斷ALV-J感染的效果及組織的保護(hù)作用效果，從而明確chNHE1在ALV-J誘導(dǎo)組織損傷中的決定性作用。
　　我們首先從SPF雞的腎臟中獲得ECL1基因并制備Anti-ECL1抗體，設(shè)置4個(gè)組：A（Normal組）、B（Anti-ECL1組）、C（AL

4、V-J組)、D（ALV-J+Anti-ECL1組）；將Anti-ECL1抗體經(jīng)細(xì)胞毒性檢測(cè)，確保對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷情況下，將Anti-ECL1抗體和ALV-J同時(shí)作用于細(xì)胞，分別通過(guò)熒光定量PCR方法和ELISA方法檢測(cè)Anti-ECL1抗體阻斷ALV-J感染的效果，檢測(cè)結(jié)果表明在48h內(nèi)，D組（ALV-J+Anti-ECL1）ALV-J NX0101 RNA拷貝數(shù)顯著低于C組（ALV-J），隨時(shí)間的延長(zhǎng)，D組（ALV-J+Anti-ECL1

5、）ALV-J NX0101 RNA拷貝數(shù)與C組（ALV-J）無(wú)差異；ELISA檢測(cè)ALV-J抗原p27表達(dá)水平在72h內(nèi)顯著低于C組，證明Anti-ECL1抗體在限定的時(shí)間內(nèi)可有效阻斷ALV-J感染DF-1細(xì)胞。擬通過(guò)給ALV-J感染雞注射Anti-ECL1抗體，檢測(cè)Anti-ECL1抗體對(duì)ALV-J感染雞組織器官的保護(hù)效果，相對(duì)定量PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，D組（ALV-J+Anti-ECL1） ALV-J NX0101拷貝數(shù)與C

6、組（ALV-J）相比顯著降低，且D組（ALV-J+Anti-ECL1） ALV-J抗原表達(dá)水平降低；在肝臟中D組（ALV-J+Anti-ECL1）ALV-JNX0101拷貝數(shù)顯著降低，但ALV-J抗原表達(dá)水平無(wú)明顯變化，結(jié)果表明Anti-ECL1抗體對(duì)感染ALV-J雞的心臟和肝臟具有保護(hù)作用，但對(duì)其他組織器官保護(hù)作用不顯著，據(jù)此我們推測(cè)Anti-ECL1抗體對(duì)組織器官的保護(hù)能力與ALV-J對(duì)組織器官的靶向性相關(guān)。為驗(yàn)證chNHE1在AL

7、V-J感染雞免疫器官的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ALV-J感染雞的骨髓，胸腺，脾臟和法氏囊等免疫器官中chNHE1均有上調(diào)，chNHE1在骨髓的髓系細(xì)胞系表現(xiàn)明顯。目前人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究表明，NHE1對(duì)心肌缺血/再灌注,心肌損傷或心臟衰竭具有重要作用，諸多相關(guān)學(xué)者研究抑制NHE1制劑或者化學(xué)藥物從而減輕心肌損傷程度，保證人身安全，本研究也為此工作提供部分參考。再者ECL1是ALV-J受體的關(guān)鍵域，但是ALV-J受體是否還具有輔助受體或者

8、其他輔助因子仍是在研究中。
　　綜上所述，本研究表明Anti-ECL1抗體可在限定時(shí)間內(nèi)有效阻斷ALV-J的感染；Anti-ECL1對(duì)心肌和肝臟具有顯著的保護(hù)作用，但ECL1域不是ALV-J感染細(xì)胞的唯一結(jié)合部位；感染ALV-J雞chNHE1在免疫組織器官表達(dá)均有上調(diào)，在骨髓髓系細(xì)胞表現(xiàn)明顯；chNHE1在ALV-J誘導(dǎo)的組織損傷中起決定作用；此發(fā)現(xiàn)為人類醫(yī)學(xué)心肌損傷的所引起的各種疾病奠定一部分參考；亦為ALV-J及相關(guān)病毒的控制