J亞群禽白血病病毒感染DF-1細胞的蛋白質組學研究.pdf

1、禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)是一類通過水平傳播或垂直傳播，造成禽產生多種良性或惡性的腫瘤的反轉錄病毒，其感染產生的腫瘤主要有淋巴細胞性白血病、成髓細胞性白血病、骨髓細胞瘤、血管瘤、禽肉瘤、內皮瘤、纖維肉瘤以及真性紅細胞增多癥等。根據病毒囊膜糖蛋白抗原差異、病毒干擾實驗以及宿主范圍，從雞體中分離的ALV可以分為6個亞群(A-E，J)。ALV-J是在1989年被分離鑒定出的禽白血病病毒亞群，主要引起肉用型

2、雞發(fā)生髓細胞瘤。近年來盡管禽白血病在世界大部分國家都得到了有效的控制，然而該病在中國卻越來越嚴重，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。目前由ALV-J引起的禽白血病在中國呈地方性流行，該病毒造成蛋雞產蛋迅速下降，并能導致蛋雞和一些地方品種雞形成血管瘤。為了探究ALV-J的致病機理以及病毒與宿主的相互作用，我們運用二維電泳結合質譜分析的差異蛋白質組學方法對DF-1細胞感染ALV-J前后的蛋白表達變化進行研究，以尋找致病和致腫瘤相關的差異表達蛋白。<

3、br>　　 1.DF-1細胞二維電泳方法的建立
　　 二維電泳是蛋白質組學研究的核心技術之一，為了研究DF-1細胞在感染病毒后的蛋白質組學變化，首先需要建立和優(yōu)化DF-1細胞二維電泳方法。在本實驗中我們使用17cm固相pH梯度膠條進行等電聚焦，對5種細胞裂解液的配方進行了優(yōu)化，同時還對蛋白在不同的等電聚焦條件、不同的水化條件、不同的蛋白上樣量、不同SDS-PAGE凝膠濃度條件下的二維電泳圖譜進行比較，并用PDQuest軟件分析

4、優(yōu)化選擇。最終確定裂解液成分為7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS，40mMDTT，0.2％Bio-Lyte3-10,1mM Protease Inhibitor Cocktail;蛋白上樣量為300μg，以主動水化的方式溶脹進入膠條;等電聚焦過程采用4，5000VH，二向凝膠濃度確定為12％。從而成功建立了DF-1細胞的二維電泳方法，獲得分辨率和重復性均可滿足分析要求的DF-1細胞的二維電泳圖譜，為后期研究病毒感染細胞的差異蛋

5、白質組學提供技術支持。
　　 2.J亞群禽白血病病毒感染DF-1細胞的蛋白質組學研究
　　 運用二維電泳結合質譜分析的蛋白質組學方法對DF-1細胞在感染ALV-J后不同時間點的細胞總蛋白的差異變化情況進行研究。結果發(fā)現感染后6h、12h、1d、2d、3d、5d和7d的7個階段共有86個差異蛋白，差異表達蛋白主要集中在感染后6-12h。質譜分析共成功鑒定出74個差異蛋白，其中30個上調，44個下調。這些差異表達蛋白從分子生

6、物學過程來分析主要參與新陳代謝過程、大分子代謝過程、生物學調控過程、應激反應、生物合成等過程;按蛋白功能來分主要具有水解酶活性以及蛋白結合、氧化還原、核酸結合等功能。通過蛋白相互作用網絡圖，我們發(fā)現DJ-1、UCHL1、PEBP1、NPM1、HMGB1、ANP32A、TRAP1和VDAC1等蛋白與細胞凋亡及腫瘤的形成、發(fā)展聯(lián)系緊密。其中DJ-1最初是作為腫瘤基因被發(fā)現的。它在細胞的轉變、蛋白-RNA相互作用的控制、氧化應激反應以及男性生

7、育等過程中起重要作用;UCHL1是去泛素化酶家族重要成員之一，在細胞增殖、細胞周期、凋亡和信號轉導多種生物學過程中起重要作用;PEBP1是一種磷脂結合蛋白，又稱Raf激酶抑制蛋白。激活的Raf蛋白與細胞生長、細胞周期停滯甚至與凋亡有關;NPM1是核仁磷酸蛋白穿梭于細胞核與細胞漿之間，參與核糖體的裝配和轉運。NPM能對DNA的損傷進行調控，可以激活NF-κB轉導因子，阻止細胞發(fā)生凋亡;HMGB1是典型的非組蛋白，屬于HMG高遷移率族蛋白。

8、HMGB1釋放于細胞外可參與炎性反應、細胞增殖、分化、遷移及神經生長等過程，并與晚期糖基化終產物受體（RAGE）結合，參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤和轉移。這些信息為進一步研究ALV-J的致病、致腫瘤機理提供了有用的蛋白質相關基礎依據。
　　 3.DJ-1、UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1基因real-timePCR標準品的制備及各基因在ALV-J感染中變化情況
　　 為了檢測DJ-1、UCHL1、VDAC1、

9、TRAP1和HMGB1基因在ALV-J感染過程中的變化，我們利用PCR的方法擴增出各基因片段，然后連接pGEM-T載體，構建各基因的載體質粒作為標準品。將鑒定正確的各基因的T載體質粒進行10倍梯度稀釋，用real-time PCR擴增各基因分別建立標準曲線。然后以ALV-J感染后的DF-1細胞為模板進行real-timePCR擴增。結果發(fā)現所有檢測基因在ALV-J感染后5d和7d均發(fā)生下調，而在感染后6h和12h，除了TRAP1下調外其

10、它檢測基因均上調。DJ-1在感染初期上調后，一直處于下調狀態(tài)。UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1在感染后1-3d并沒有明顯的變化規(guī)律。TRAP1在感染后6h和2d下調超過10倍，而在感染后1d上調超過10倍。這些基因轉錄水平變化規(guī)律一方面部分驗證了在二維電泳中各差異蛋白的變化，另一方面豐富了蛋白質組學的研究內容，也為進一步研究這些蛋白的功能提供了借鑒。
　　 4.雞源DJ-1蛋白的原核表達及多抗血清的制備
　　

11、 DJ-1與癌癥的發(fā)生和發(fā)展緊密相關，在一些腫瘤組織或細胞內，DJ-1的表達顯著高于相鄰的外周組織或正常細胞。在禽白血病病毒J亞群(ALV-J)的早期感染的蛋白質組研究中發(fā)現了DJ-1蛋白的上調。為了進一步研究DJ-1蛋白在ALV-J感染中的生物學作用，從DF-1細胞的cDNA中擴增DJ-1基因編碼區(qū)，連接T載體后克隆入pET-32a載體進行原核表達，之后對表達的蛋白進行純化并免疫BALB/c小鼠制備多抗血清。實驗結果表明:IPTG終