禽J亞群白血病病毒感染細(xì)胞外泌體免疫作用研究.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的以禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生為主的腫瘤性傳染病。ALV是一群具有囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒，除了對(duì)禽群的直接危害外，還可引起禽群嚴(yán)重的免疫抑制，導(dǎo)致生產(chǎn)力下降，混合感染、繼發(fā)感染頻發(fā)。一直以來(lái)，由于ALV病毒群的多樣性、病毒自身的特殊性以及引起疾病的復(fù)雜性，國(guó)內(nèi)外雖進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)免疫抑制的機(jī)制仍不是很明確。
　　 外泌體(Exosomes)的

2、發(fā)現(xiàn)，為ALV引起免疫抑制的研究提供了新思路，在ALV與效應(yīng)細(xì)胞間架起了橋梁。著名的“特洛伊木馬假說(shuō)”認(rèn)為，逆轉(zhuǎn)錄病毒利用宿主細(xì)胞固有的Exosomes形成和釋放途徑，利用Exosomes再攝取的途徑，形成不依賴于包膜蛋白的感染模式作用于其它細(xì)胞。Amy等研究發(fā)現(xiàn)在感染人類免疫缺陷病病毒（HumanImmunodeficiency Virus，HIV）的細(xì)胞分泌的Exosomes上，檢測(cè)到含有HIV的gag蛋白成分。由此，我們推測(cè)在AL

3、V感染的細(xì)胞分泌的Exosomes上除了gag蛋白外，可能還攜帶ALV的其他蛋白成分，比如囊膜(env)蛋白（含有ALV的免疫抑制區(qū)），攜帶ALV蛋白成分的Exosomes會(huì)對(duì)遠(yuǎn)程細(xì)胞產(chǎn)生與ALV相似的免疫抑制作用，即攜帶ALV蛋白成分的Exosomes會(huì)在禽白血病早期造成免疫抑制的微環(huán)境，利于ALV在機(jī)體內(nèi)的進(jìn)一步感染與轉(zhuǎn)移。為研究ALV-J感染細(xì)胞分泌的Exosomes(Exo-J)含有ALV-J的某些蛋白成分，并在ALV-J造成的

4、免疫抑制中有重要作用，我們將提取的Exo-J蛋白和正常DF-1細(xì)胞分泌的外泌體(Exo)變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blot分析，在26KD左右二者的差異條帶，將條帶切膠后酶解，液相串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，Exo及Exo-J都含有Exosomes的特征性蛋白，如HSP70、丙酮酸激酶、14-3-3與肌動(dòng)蛋白等，HSP70蛋白家族常作為Exosomes的標(biāo)志性蛋白。Exo-J含有ALV-J的env和gag蛋白，ALV g

5、ag基因在各亞群間有高度的同源性，gag基因編碼的蛋白主要有27KDa、19KDa、15KDa、12KDa，27KDa即是各亞群均共有抗原的gs群特異性抗原。Env蛋白，即env基因編碼的病毒囊膜糖基化蛋白，包括跨膜糖蛋白亞單位(TM)和膜表面糖蛋白亞單位(SU)。SU含有病毒，受體決定簇，決定亞群特異性和宿主范圍;TM介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合過(guò)程。在ALV-J感染細(xì)胞分泌的Exosomes中發(fā)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的存在，說(shuō)明Exo-J在ALV-

6、J感染過(guò)程可免疫抑制中發(fā)揮重要作用。
　　 為研究攜帶了病毒成分的Exo-J具有與ALV-J相似的免疫抑制作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了Exosomes對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖作用的體外實(shí)驗(yàn)。分離42日齡SPF雞脾臟白細(xì)胞，加入一定劑量的Exosomes共培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，Exo對(duì)淋巴沒(méi)有免疫抑制作用，維持在正常水平;低劑量時(shí)，Exo-J促進(jìn)CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖，但隨著劑量的增加CD4+

7、、CDS+T細(xì)胞的數(shù)量降低，這也與實(shí)際ALV感染機(jī)體細(xì)胞的情況類似，感染機(jī)體/細(xì)胞的病毒越多分泌的Exo-J越多，機(jī)體的免疫抑制作用越明顯。為進(jìn)一步研究Exo-J與ALV-J是否具有免疫抑制協(xié)同作用，設(shè)計(jì)Exo-J與ALV-J對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖作用的體外實(shí)驗(yàn)。在分離得到的脾臟白細(xì)胞中加入Exo-J和ALV-J，結(jié)果顯示，單獨(dú)加入Exo-J(20μg)、ALV-J實(shí)驗(yàn)組，CD4+、CD8+數(shù)量明顯低于正常對(duì)照組，ALV-J組抑制作用更強(qiáng)，

8、但當(dāng)兩者共同作用時(shí)，其抑制作用沒(méi)有增強(qiáng)，反而弱于單一(ALV-J或Exo-J)作用組，與預(yù)期結(jié)果完全相反，這種現(xiàn)象可能是由于Exo-J和ALV-J在同一體系中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的細(xì)胞受體有關(guān)，從而導(dǎo)致免疫抑制能力減弱，這種推測(cè)還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 有研究表明，Env蛋白與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合是病毒進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制。以往的研究也表明，Env蛋白與ALV的免疫抑制密切相關(guān)。經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，Exo-J中含有ALV-J的En

9、v蛋白，并在Exosomes對(duì)淋巴細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出對(duì)免疫細(xì)胞（系統(tǒng)）的干擾作用，這可能是Exo-J上攜帶的Env蛋白發(fā)揮的作用，Exo-J起到遠(yuǎn)程傳遞的作用，其上含有的env蛋白起到作為配體尋找受體的功能，從而為ALV-J的傳播創(chuàng)造相應(yīng)的微環(huán)境。因此，確定病毒免疫抑制作用的基因區(qū)域，是未來(lái)的研究方向。
　　 綜上所述，本研究對(duì)DF-1細(xì)胞分泌Exosomes的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)Exosomes的物理性狀及生物學(xué)活性進(jìn)