禽β-防御素6(AvBD6)組織定位及抗J亞群禽白血病病毒活性研究.pdf

1、近年來，隨著家禽集約化飼養(yǎng)、高密度飼養(yǎng)等造成全球腫瘤性免疫抑制疫病的爆發(fā)，例如ALV-J、MDV、REV等。J亞群禽白血病主要引起以髓細胞瘤和其他細胞惡性腫瘤增生為特征的傳染性腫瘤性疾病。自我國出現(xiàn)ALV-J以來，其感染宿主范圍不斷擴大，發(fā)病日齡逐漸提前，導(dǎo)致的腫瘤類型不斷增多，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前對于ALV-J尚無有效的預(yù)防和治療手段，因此尋求一種能有效抑制ALV-J病毒的細胞內(nèi)防御蛋白是必要的。
　　禽β-防御素

2、(AvBD)是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的宿主防御蛋白，主要特征結(jié)構(gòu)是含有6個半胱氨酸殘基構(gòu)成的3對二硫鍵，是機體防御微生物入侵體內(nèi)的第一道屏障。具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌的生物學(xué)作用，在禽類的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。
　　為進一步研究雞AvBD的組織分布及抗病毒作用，本研究運用PCR方法，從SPF雞的肝臟組織中擴增到雞AvBD6基因。將測序結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)禽β-防御素和不同種屬禽β-防御素的氨基酸序列進行同源性分析、繪制分子

3、遺傳進化樹。結(jié)果顯示，AvBD6基因前體肽由67個氨基酸殘基組成，其cDNA全長為204bp，含有6個穩(wěn)定的半胱氨酸，分別以1-5、2-4、3-6連接形成3個分子的二硫鍵，構(gòu)成穩(wěn)定的反相平行的3股β-片層結(jié)構(gòu)C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C，與雞AvBD7氨基酸同源性最高為62.7％。
　　將雞AvBD6基因亞克隆到表達載體pGEX-6p-1上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-AvBD6，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到

4、Rosseta(ER2566)感受態(tài)細胞，用IPTG誘導(dǎo)表達雞AvBD6融合蛋白，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。將雞AvBD6重組蛋白進行包涵體純化，再免疫新西蘭大白兔，制備其多克隆抗體，經(jīng)ELISA測定雞AvBD6融合蛋白多克隆抗體效價為1∶211。用自制的多克隆抗體建立特異性檢測雞AvBD6分布免疫組化方法，對SPF雞組織器官中AvBD6進行檢測分析，在骨髓的髓系細胞、肺的呼吸毛細管上皮細胞、腎小管上皮細胞、十二指腸的腸絨毛上皮細胞等分

5、布較多。運用建立的雞AvBD6實時熒光定量PCR檢測方法對雞AvBD6組織表達差異、不同日齡SPF雞的AvBD6動態(tài)表達規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn):AvBD6在骨髓中表達極高，在肺、腎、肝、脾組織器官的表達量相對較高，其它各組織器官均有不同程度的表達;隨著日齡的增長AvBD6呈現(xiàn)“波浪”形規(guī)律。
　　為了明確AvBD6是否具有抗ALV-J作用，運用蛋白透析復(fù)性法，獲得具有天然結(jié)構(gòu)的AvBD6重組蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AvBD6重組蛋白具有良好的抑制