雞CCCH型ZAP抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制及對其組織嗜性影響的研究.pdf

1、CCCH型鋅指抗病毒蛋白(ZAP)為宿主防御因子之一，具mRNA結(jié)合特性，在RNA病毒感染時(shí)，會(huì)通過與病毒mRNA作用，而使之失去感染性，可對抗突變的病毒。J亞群禽白血病病毒(ALV-J)為致瘤RNA病毒，由于其自身的超突變性以及引起疾病的復(fù)雜性，至今未研制出有效的疫苗或藥物，嚴(yán)重危害了我國的養(yǎng)禽業(yè)。因此，CCCH型ZAP有望成為下一代抗ALV-J的藥物，然而對于禽CCCH型ZAP的基因特征、組織分布及抗病毒效果等問題，目前尚未有研究。

2、本實(shí)驗(yàn)室前期證明，雞膽汁外泌體(exosome)具有抑制ALV-J復(fù)制的功能，對其進(jìn)行蛋白組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)雞膽汁exosome內(nèi)出現(xiàn)新型蛋白，即CCCH型鋅指抗病毒蛋白(ZAP)，因此推測可能是CCCH型ZAP具有抑制ALV-J復(fù)制的作用。
　　基于上述發(fā)現(xiàn)，我們首先對雞體內(nèi)的chZAP基因序列的保守性進(jìn)行了分析。分別從正常SPF雞的肝臟、脾臟、腎臟及DF-1細(xì)胞中獲得了雞CCCH型鋅指抗病毒蛋白(chZAP)基因。序列比對分析發(fā)現(xiàn)

3、，雞不同組織器官及DF-1細(xì)胞的chZAP基因序列完全一致;而不同物種（禽、鼠、人）之間的鋅指抗病毒蛋白具有種屬差異性，但其四個(gè)CCCH型鋅指模體卻具有保守性。序列比對結(jié)果表明CCCH型鋅指模體在動(dòng)物進(jìn)化過程中被完整保留具有超保守性，為我們研究其抗病毒特性奠定了理論基礎(chǔ)。
　　為了探究chZAP是否具有抗ALV-J復(fù)制作用，分別通過慢病毒重組載體轉(zhuǎn)染和原核表達(dá)獲得chZAP作用于ALV-J感染的細(xì)胞系。通過構(gòu)建chZAP慢病毒重組

4、載體將chZAP基因插入DF-1細(xì)胞基因組內(nèi)，免疫熒光和Western blot檢測證實(shí)chZAP在DF-1中超表達(dá)后，接種ALV-J，隨后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。檢測結(jié)果表明超表達(dá)的chZAP能夠顯著抑制ALV-J的復(fù)制，但其抑制效果呈現(xiàn)表達(dá)水平依賴性。通過原核表達(dá)的chZAP作用于ALV-J感染細(xì)胞，觀察chZAP是否可以抑制ALV-J的復(fù)制，結(jié)果表明原核表達(dá)的chZAP能夠顯著抑制ALV-J的復(fù)制。因此，證明chZAP能夠有效抑制

5、ALV-J的復(fù)制。
　　基于以上結(jié)果，推測chZAP在組織中的表達(dá)可能會(huì)影響ALV-J的組織嗜性。通過免疫組織化學(xué)及絕對定量PCR，證明chZAP在各組織中廣泛表達(dá)，但是表達(dá)水平呈現(xiàn)差異性;表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;在大部分組織中，chZAP自然表達(dá)水平較高時(shí)，病毒負(fù)載量較低，而在個(gè)別組織中如脾，chZAP自然表達(dá)水平不是很高，但是ALV-J感染后表達(dá)呈現(xiàn)顯著上升趨勢，病毒負(fù)載量相對其他組織亦較低，所以chZAP對組織的保護(hù)

6、程度有可能不僅取決于其自然表達(dá)水平，亦取決于其可誘導(dǎo)程度。然而，SPSS分析顯示chZAP的表達(dá)與ALV-J感染程度不呈明顯相關(guān)。目前有研究表明，ALV-J的組織嗜性主要與env、LTR基因和ALV-J受體chNHE1有關(guān)。所以，盡管chZAP作為宿主防御因子在過表達(dá)時(shí)能夠顯著抑制ALV-J的復(fù)制，但是，chZAP只是影響ALV-J的組織嗜性而不是ALV-J組織嗜性的決定因子。
　　綜上所述，本研究表明chZAP是限制ALV-J復(fù)