納米殼聚糖-RNA干擾重組質(zhì)粒復(fù)合物體內(nèi)抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制.pdf

1、J亞群禽白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J)引起的以髓細(xì)胞瘤和其他細(xì)胞惡性腫瘤為特征的傳染性腫瘤性疾病。自1988年從雞中首次分離以來(lái)，ALV-J在世界各地雞群廣泛流行。特別是2009年以來(lái)，ALV-J在我國(guó)一些蛋雞群中暴發(fā)，發(fā)病率高達(dá)60％，致雞死亡率超過(guò)30%，該病對(duì)我國(guó)造成的危害很大。由于亞群間各毒株比較相近，但不同遺傳特征的病毒引起的不同腫瘤的潛伏期不同，所

2、以目前尚無(wú)有效防治 J亞群禽白血病的方法；由于ALV-J的垂直傳播性、先天感染的免疫耐受雞是主要的傳染源，目前也無(wú)可用的疫苗，當(dāng)前控制J亞群禽白血病的有效措施是凈化淘汰為主，因此，RNAi小分子核酸藥物在無(wú)疫苗的禽白血病病毒防治中具有廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)室前期針對(duì)ALV-J NX0101毒株的env基因中g(shù)p85編碼區(qū)篩選到了siRNA，將篩選到的siRNA置于miRNA骨架結(jié)構(gòu)中，人工合成，再將其克隆到 pcDNATM6.2-GW/Em

3、GFP-miR真核表達(dá)載體中，構(gòu)建了p-miR-env干擾表達(dá)質(zhì)粒，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)p-miR-env干擾表達(dá)質(zhì)?？捎行б种艫LV-J的復(fù)制，但其在體內(nèi)也是否具有相似的抑制效果？這一問(wèn)題將在本課題中解決。
　　到目前為止，RNAi的導(dǎo)入系統(tǒng)有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體雖然體外轉(zhuǎn)染效率高，體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)。但其存在很嚴(yán)重的安全問(wèn)題，且目的基因容量小，制備復(fù)雜，成本高，不能體內(nèi)反復(fù)使用，所以在臨床應(yīng)用上受到了很大的限制。而以納米

4、粒子復(fù)合體等的非病毒基因傳遞系統(tǒng)，在保持一定轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，對(duì)其加以修飾，增加體內(nèi)作用時(shí)間，就可以避開(kāi)臨床安全性障礙，加速siRNA藥物進(jìn)入臨床治療。殼聚糖作為唯一天然存在的正電性高分子聚糖，它還具有細(xì)胞毒性低、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)酶存在下也穩(wěn)定，可保護(hù)所結(jié)合基因，又可根據(jù)需要程序性降解，且降解產(chǎn)物無(wú)副作用。另外，由于動(dòng)物細(xì)胞的平均直徑約為10μm，其細(xì)胞核的大小通常要小10倍以上，因此，大體積的外來(lái)基因載體復(fù)合物細(xì)胞導(dǎo)入率低，理想

5、的復(fù)合物體積應(yīng)控制在納米級(jí)。根據(jù)殼聚糖分子量，脫乙?；潭纫约皻ぞ厶桥c基因的用量比等因素可將殼聚糖基因復(fù)合體的尺寸控制在100納米左右，從而順暢進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞。此外，在生理?xiàng)l件下其他非病毒類載體會(huì)與血清蛋白作用，導(dǎo)致基因傳導(dǎo)效率大大下降，而殼聚糖在血清或體液環(huán)境中卻保留了很高的基因傳導(dǎo)效率。因此，納米殼聚糖在基因遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用備受推崇。
　　鑒于殼聚糖所具有的良好的生物相容性、生物降解性，我們選擇實(shí)驗(yàn)室篩選到的抑制ALV-J囊膜蛋

6、白基因的p-miR-env重組干擾表達(dá)質(zhì)粒作為干擾靶位點(diǎn)，通過(guò)納米技術(shù)制備殼聚糖納米粒，包被重組質(zhì)粒，使p-miR-env緩慢釋放，并能有效的轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,抑制病毒復(fù)制，有望成為控制ALV-J一種新手段。
　　利用本實(shí)驗(yàn)室前期制備的P-miR-env重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，大量制備去內(nèi)毒素質(zhì)粒，采用復(fù)凝聚法制備CTS-P-miR-env納米粒。通過(guò)透射電鏡負(fù)染觀察納米粒的形態(tài)及大?。涣椒治鰷y(cè)量?jī)x測(cè)定納米粒的粒徑；微量紫外分光光度計(jì)測(cè)

7、定CTS-p-miR-en v上清中的游離質(zhì)粒的含量，計(jì)算包封率；凝膠電泳法測(cè)定納米粒的穩(wěn)定性；凝膠電泳法分析納米粒在胎牛血清中的穩(wěn)定性。通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)研究CTS-P-miR-env納米粒在體內(nèi)抑制ALV-J效果，利用制備好的CTS-p-miR-env納米制劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，SPF雛雞分為8組，其中1組為空白對(duì)照組；2組為接毒對(duì)照組；3組為陰性對(duì)照組；4組為CTS-p-miR-env納米制劑組；5組為裸質(zhì)粒對(duì)照組；6組為CTS-p-miR-

8、env納米制劑低劑量組；7組為CTS-p-miR-env納米制劑中劑量組；8組為CTS-p-miR-env納米制劑高劑量組；采棉拭子檢測(cè)ALV-J p27，對(duì)其排毒情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)；通過(guò)體重稱量對(duì)比、血液學(xué)檢測(cè)、大體病變觀察和組織學(xué)病變觀察等評(píng)估CTS-p-miR-env納米制劑在體內(nèi)的抗ALV-J效果。
　　CTS-P-miR-env納米粒制備結(jié)果：（1）成功制備了CTS-p-miR-env納米粒，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)納米粒呈球形，形狀一

9、致；（2）粒徑分析測(cè)量?jī)x測(cè)定其90%粒徑為102nm，平均粒徑為88nm；（3）包封率為86%；（4）電泳結(jié)果表明CTS-p-miR-env納米粒性質(zhì)穩(wěn)定，能夠阻止胎牛血清中Rnase對(duì)siRNA的降解，具有保護(hù) siRNA的作用。由此可見(jiàn)離子凝膠法可制備粒度分布均勻，形態(tài)規(guī)則，具有較高包封率的CTS-p-miR-env納米粒。CTS-p-miR-env納米粒對(duì)siRNA具有酶解保護(hù)作用，適合作為基因遞送載體。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

10、（1）p27實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出接毒組均呈抗原陽(yáng)性，空白對(duì)照組均呈陰性，裸DNA接毒組在20日齡和24日齡出現(xiàn)排毒，納米制劑中劑量接毒組在28日齡出現(xiàn)排毒，納米制劑高劑量接毒組未出現(xiàn)排毒，S/P值一直較低；（2）在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，ALV-J接毒組白細(xì)胞數(shù)減少，說(shuō)明雞在接毒后病毒對(duì)骨髓造血體統(tǒng)產(chǎn)生的危害作用，導(dǎo)致雞的造血機(jī)能下降，從而使白細(xì)胞的總數(shù)減少，白細(xì)胞數(shù)量的減少趨勢(shì)與淋巴細(xì)胞百比例的下降趨勢(shì)相似。裸DNA接毒對(duì)照組以及納米制劑接毒對(duì)照組

11、白細(xì)胞數(shù)量明顯高于接毒組，說(shuō)明其對(duì)骨髓的起到保護(hù)作用；同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)納米制劑接毒組由低劑量到高劑量白細(xì)胞數(shù)量依次增高，而且均高于裸DNA接毒組，說(shuō)明納米制劑對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用強(qiáng)于裸質(zhì)粒；（3）大體剖檢病變觀察可以看出接毒組心臟、脾臟、肝臟、胸腺、法氏囊出現(xiàn)明顯萎縮，納米制劑接毒組由低劑量到高劑量心臟、脾臟、肝臟、胸腺、法氏囊逐漸趨于正常，而且相比裸質(zhì)粒組效果更好；（4）通過(guò)病理組織學(xué)觀察可以看出，接毒組心肌明顯出血、形成淋巴細(xì)胞炎性灶；肝

12、臟出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞炎性灶；腎臟出血；肺臟充血，間質(zhì)增寬；脾臟淋巴細(xì)胞流失，數(shù)量明顯減少?？瞻讓?duì)照組各組織均正常。裸質(zhì)粒組與納米制劑低劑量接毒組出現(xiàn)輕微病變，納米制劑中劑量與高劑量接毒組跟正常對(duì)照組相似。
　　由此看出本實(shí)驗(yàn)成功制備的CTS-P-miR-env納米粒分布均勻，形態(tài)規(guī)則，具有較高包封率，對(duì)siRNA具有酶解保護(hù)作用，可有效傳遞P-miR-env。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)CTS-P-miR-env具有抑制ALV-J復(fù)制作用，而且納米