J亞群禽白血病病毒表位疫苗候選抗原表位的篩選與鑒定.pdf

1、J亞群禽白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的主要以髓細(xì)胞過度增生的可傳染的腫瘤性疾病，主要引起機(jī)體的生長抑制、免疫抑制以及多器官組織出現(xiàn)腫瘤。我國于1999年首次發(fā)現(xiàn)肉雞感染此病毒后，發(fā)現(xiàn)其宿主范圍不斷擴(kuò)大，不僅感染蛋雞，而且向地方種雞擴(kuò)散;致瘤譜擴(kuò)展、致瘤性明顯增強(qiáng)，發(fā)病日齡提前，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤、成紅細(xì)胞瘤等多種腫瘤，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的損失。鑒于病毒高度變異特性以及免疫逃避機(jī)制，傳統(tǒng)弱

2、毒疫苗、滅活疫苗尚不能提供有效的保護(hù)能力，國外對(duì)于此病的防控措施主要是通過種源凈化的方式，不斷淘汰感染陽性雞群，取得了較好的效果，但養(yǎng)殖成本相對(duì)較高。而我國的養(yǎng)殖業(yè)水平相對(duì)較低，行業(yè)發(fā)展程度不高，難以完全通過凈化的方式控制疾病的發(fā)生。目前，ALV-J在我國流行形勢嚴(yán)峻，亟需開發(fā)有效的新型疫苗。
　　表位疫苗是一種新型亞單位疫苗，越來越受到更廣泛的關(guān)注和研究，其優(yōu)勢眾多，可以克服傳統(tǒng)疫苗造成的毒力恢復(fù)或散毒的可能?？乖砦浑亩绦〉?/p>

3、疫原性更強(qiáng)，可以克服組織相容復(fù)合體的遺傳限制。對(duì)于ALV-J這種高度變異的病毒，多表位疫苗含有廣譜的表位信息，可以避免毒株的變異導(dǎo)致的免疫失敗，從而提供更完全、更有針對(duì)性的免疫保護(hù)，為疾病的防控凈化提供了條件。篩選和鑒定更多的抗原表位，不僅有助于了解病毒抗原結(jié)構(gòu)，而且為表位疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先獲得ALV-J病毒結(jié)構(gòu)和抗原相關(guān)信息，采用預(yù)測法分析囊膜蛋白的抗原表位，篩選出代表近幾年中國流行毒株的表位基因序列，采用編

4、碼甘氨酸、絲氨酸的密碼子進(jìn)行串聯(lián)，基因片段cENV由生物公司合成后構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，選用不同表達(dá)載體對(duì)表達(dá)重組蛋白純度進(jìn)行優(yōu)化選擇，純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Western Blot分析，確定重組蛋白獲得高效表達(dá)并且具有免疫原性后進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。
　　通過動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得的重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，并且刺激雞體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，抗體維持時(shí)間接近14周。利用制備的高效價(jià)血清進(jìn)行體外病毒中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示具有明顯的

5、病毒中和效果，達(dá)到40％-50％。對(duì)于高度變異的病毒，有必要進(jìn)一步精確定位超變區(qū)的抗原表位，完善表位圖譜，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。我們先將gp85片段分段進(jìn)行原核表達(dá)，利用實(shí)驗(yàn)室制備的針對(duì)ALV-J gp85超變區(qū)的單抗2D5，對(duì)分段表達(dá)的抗原片段進(jìn)行分析，初步確定抗原表位肽段區(qū)域，進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成小肽進(jìn)行表位映射，精確定位了超變區(qū)hr1抗原表位序列為LRDFIAKWKSDDLLIRPYVNQS。
　　經(jīng)過表位氨基酸序列同源性比對(duì)分析，我

6、們發(fā)現(xiàn)表位主要存在三個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變異，變異氨基酸主要在于第六位氨基酸A變?yōu)镋或T，針對(duì)氨基酸變異設(shè)計(jì)合成小肽分析氨基酸變異對(duì)表位抗原性的影響。確定此位點(diǎn)氨基酸變異是導(dǎo)致表位抗原性改變的關(guān)鍵氨基酸。利用臨床采集的ALV-J陽性血清，進(jìn)一步分析變異前后表位肽的免疫原性，結(jié)果顯示不同表位肽均只與陽性血清反應(yīng)，說明我們鑒定的表位肽具有良好的反應(yīng)原性，也初步確定感染ALV-J的雞群產(chǎn)生的抗體存在多種狀態(tài)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究鑒定的抗原表位，豐