J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合域鑒定及親合力差異研究.pdf

1、J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis virus，ALV-J)引起的腫瘤性傳染病。ALV-J最早發(fā)現(xiàn)于商品肉雞，但近年來(lái)在我國(guó)蛋雞群和本地雞群中也大規(guī)模流行。該病毒宿主范圍明顯擴(kuò)大，致病性增強(qiáng)，且囊膜蛋白出現(xiàn)了明顯的變異。gp85蛋白是ALV-J的囊膜表面蛋白，含有病毒-受體決定簇，能夠識(shí)別宿主細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，從而決定亞群特異性及宿主范圍。本研究鑒定了ALV-J gp85蛋白

2、與細(xì)胞受體的關(guān)鍵結(jié)合域，并進(jìn)一步研究了gp85蛋白序列的差異對(duì)其與受體結(jié)合的影響及可能的機(jī)制。
　　已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，A～E亞群ALV的gp85蛋白與相應(yīng)受體的結(jié)合域集中在hr1、hr2區(qū)域。為鑒定ALV-J的gp85蛋白與細(xì)胞受體chNHE1的結(jié)合域，本研究表達(dá)了可溶性的具有生物學(xué)活性的ALV-J原型株HPRS-103 gp85蛋白，利用流式細(xì)胞術(shù)建立了檢測(cè)gp85蛋白與受體chNHE1結(jié)合能力的方法。采用HA標(biāo)簽逐段替換gp8

3、5蛋白全序列的策略，共構(gòu)建了33個(gè)嵌合質(zhì)粒，表達(dá)并純化了33種gp85嵌合蛋白。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，23種嵌合的gp85蛋白喪失了與chNHE1的結(jié)合能力。病毒阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，gp85蛋白與受體chNHE1的結(jié)合域集中在第37-283位不連續(xù)的氨基酸序列區(qū)域，不僅限于hr1、hr2區(qū)域。
　　對(duì)多株ALV-J的gp85蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，近些年國(guó)內(nèi)流行株的gp85序列與以HPRS-103為代表的肉雞分離株的gp85序列間存在規(guī)

4、律性的氨基酸變異。復(fù)制動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)流行株JL08CH3-1的復(fù)制能力明顯高于原型株HPRS-103。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明，JL08CH3-1的gp85蛋白(JL3-1-gp85)與chNHE1的結(jié)合能力高于HPRS-103的gp85蛋白(HPRS-103-gp85)，且二者的受體結(jié)合能力差異隨gp85蛋白濃度降低而更加明顯。為探討復(fù)制能力和受體結(jié)合能力的差異是否與規(guī)律性的氨基酸變異有關(guān)，對(duì)兩組gp85蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)

5、在受體結(jié)合域內(nèi)兩組蛋白存在23個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。以HPRS-103-gp85為骨架，將該23個(gè)差異位點(diǎn)突變成JL3-1-gp85相應(yīng)的氨基酸。受體結(jié)合試驗(yàn)證明，只有E114-/R117G/N123I三個(gè)氨基酸協(xié)同突變的HPRS-103-gp85(HPRS-103-gp85E114-/R117G/N123I)與受體結(jié)合能力明顯升高，與JL3-1-gp85的受體結(jié)合能力相近。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，可溶性表達(dá)了受體功能域chNHE1的第一個(gè)膜

6、外環(huán)(chECL1)，利用表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)不同gp85蛋白與chECL1蛋白的親和力。結(jié)果表明，JL3-1-gp85和HPRS-103-gp85E114-/R117G/N123I與受體功能域chECL1的親和力都約為HPRS-103-gp85的2倍，進(jìn)一步證實(shí)，JL3-1-gp85與細(xì)胞受體的親和力高于HPRS-103-gp85的受體親和力，且該親和力差異是由gp85序列的114，117和123位氨基酸突變所致。
　　本研究