J亞群禽白血病病毒多表位蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J)首次分離于上個(gè)世紀(jì)80年代的英國(guó)，是外源性ALV與宿主內(nèi)源性序列EAV-HP的重組體。ALV-J感染后會(huì)導(dǎo)致高發(fā)病率、雞體生長(zhǎng)遲緩和腫瘤，給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管一些國(guó)家的種禽公司已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了種雞群ALV-J的凈化工作，但是由于ALV在養(yǎng)雞業(yè)的廣泛流行、我國(guó)養(yǎng)殖模式的多樣化、規(guī)模參差不齊等特點(diǎn)，在我國(guó)地方種雞群中進(jìn)行ALV-

2、J的凈化工作還是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。J亞群禽白血病的高發(fā)病率和宿主范圍的廣泛性使其成為獸醫(yī)工作者持續(xù)關(guān)注的焦點(diǎn)。疫苗免疫是一種劃算可行的控制臨床疾病的有效方式。ALV是一種主要通過垂直傳播的疾病，在宿主體內(nèi)容易引起免疫耐受而很難誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生，給疫苗研究造成了很大的困難，目前尚無(wú)可用的ALV商品化疫苗。因此，研制一種有效、安全的疫苗來(lái)預(yù)防ALV-J的廣泛流行迫在眉睫。研究表明，單一抗原的免疫原性較差且誘導(dǎo)的免疫保護(hù)有限。一種以表位為基

3、礎(chǔ)的包含病原體多個(gè)保護(hù)性抗原表位的多表位疫苗可以克服這些缺點(diǎn)。本研究中設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一個(gè)基于ALV-J NX0101毒株的嵌合多表位基因來(lái)制備相應(yīng)的多表位疫苗，并評(píng)估了其在雞體內(nèi)的免疫效果及攻毒保護(hù)率，期望其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能抵抗ALV-J的感染，為探索ALV-J疫苗的研制提供方法和思路。
　　1、嵌合多表位基因的設(shè)計(jì)和構(gòu)建
　　通過生物信息學(xué)軟件及相關(guān)網(wǎng)站分析ALV-J中國(guó)典型毒株NX0101三個(gè)主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol和e

4、nv所編碼蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，根據(jù)親水性、柔韌性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面可及性等選擇標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)比較近幾年ALV-J流行毒株的同源性，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的研究報(bào)道，篩選出4段抗原表位集中且序列保守的區(qū)域Gag(278-376aa)，Pol(784-855aa)，Env(Gp85:145-156aa和Gp37:412-538aa)以柔性肽GAGS作為L(zhǎng)inker，將篩選的4段抗原表位基因依次串聯(lián)成一條全新的嵌合多表位基因X。分析表明，構(gòu)建的嵌合多表

5、位基因X有良好的親水性、柔性及抗原性等，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，該研究豐富了ALV-J結(jié)構(gòu)蛋白的生物信息學(xué)資料，為ALV-J嵌合多表位基因的原核表達(dá)及DNA疫苗的制備提供了基礎(chǔ)材料。
　　2、嵌合多表位基因的原核表達(dá)和特異性檢測(cè)
　　將構(gòu)建的嵌合多表位基因X用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后克隆入表達(dá)載體PET-30a(+)進(jìn)行原核表達(dá)研究。通過優(yōu)化表達(dá)條件，確定了重組嵌合多表位蛋白X(rCMEPX)表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間

6、為4h，IPTG濃度為0.5mM/mL。用臨床ALV-J陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行Western-blots分析，結(jié)果證明rCMEPX表達(dá)成功并且能與臨床ALV-J陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接ELISA實(shí)驗(yàn)評(píng)估了rCMEPX與臨床ALV-J陽(yáng)性血清反應(yīng)的反應(yīng)原性、特異性和敏感性。以純化的rCMEPX為抗原包被酶標(biāo)板，篩選出rCMEPX的最佳包被濃度為0.125μg/mL，抗體最佳稀釋度為1:40，酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記羊抗雞IgG)的最佳稀釋

7、度為1∶5000，血清樣品的陰陽(yáng)性臨界值為0.152，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rCMEPX有良好的免疫反應(yīng)性，為ALV-J蛋白質(zhì)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　3、嵌合多表位基因DNA疫苗的制備
　　將嵌合多表位基因X克隆入真核表達(dá)載體pVAX1來(lái)評(píng)估其作為DNA疫苗的潛力。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確后，通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，利用間接免疫熒光檢測(cè)重組真核質(zhì)粒在體外的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pVAX1-X的D

8、F-1細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)特異性的綠色熒光而轉(zhuǎn)染了pVAX1質(zhì)粒的細(xì)胞無(wú)綠色熒光出現(xiàn)，表明嵌合多表位基因能在真核細(xì)胞中得到表達(dá)。大量提取并純化重組真核質(zhì)粒為ALV-J嵌合多表位基因DNA疫苗的制備提供了試驗(yàn)材料。
　　4、嵌合多表位基因相關(guān)疫苗的制備及免疫效果評(píng)價(jià)
　　將構(gòu)建的嵌合多表位基因X分別制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)疫苗(rCMEPX)和DNA疫苗(pVAX-X)并評(píng)價(jià)了這兩種疫苗在雞體內(nèi)的免疫效果和攻毒保護(hù)率。結(jié)果表明該嵌合多表位蛋白