人工合成漢坦病毒多表位DNA疫苗的構(gòu)建及免疫活性研究.pdf

1、目的：
　　 漢坦病毒(hantavirus,HV)是布尼亞病毒科(bunyavirida)漢坦病毒屬(genushantavirus)的成員,為單股負(fù)鏈RNA病毒,由大(L)、中(M)和小(S)三個基因片段組成,分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)。其包膜糖蛋白是病毒的毒力位點、中和抗原位點、型特異性抗原位點和血凝抗原位點所在,可刺激機體產(chǎn)生中和抗體

2、,對感染動物和人體產(chǎn)生保護(hù)作用,是病毒致病性和疫苗研究的重點。
　　 HV主要潛伏于黑線姬鼠、褐家鼠等嚙齒類動物體內(nèi),可通過呼吸道、消化道或直接接觸等途徑感染人體,引起人類腎綜合癥出血熱(hemorrhagic fever withrenal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合癥(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。我國是HFRS高發(fā)地區(qū),己有30個省市被證實為本病的疫區(qū),迄今累計發(fā)病

3、人數(shù)近180萬,占世界總發(fā)病數(shù)的90％以上。HFRS好發(fā)人群多是青壯年,并發(fā)癥多,而且治療困難,病死率高達(dá)1～15％。目前HFRS的抗病毒藥尚未取得令人滿意的效果。因此,疫苗的研制對HFRS防治具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 傳統(tǒng)的疫苗研制方法(滅活疫苗、減毒活疫苗以及亞單位疫苗等)都具有許多無法克服的缺點:研制周期長;不適用于在體外無法培養(yǎng)的病原體;存在不安全因素(減毒活疫苗可由于病毒毒力返祖而致病);疫苗只對某一血清型或亞型的病

4、原體有效,而不能抵抗異型病原體的侵襲。我國目前臨床廣泛應(yīng)用的是HV雙價滅活疫苗,主要針對漢灘病毒(hantaan virus,HTNV)和漢城病毒(seroul virus,SEOV)開發(fā)研制,由于其研制周期長,保護(hù)范圍窄,對發(fā)生變異的HNTV、SEOV和HV其他亞型不能起到有效的預(yù)防作用。多表位DNA疫苗的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)疫苗的缺陷,為病毒疫苗的研究開辟了一條新思路。多表位疫苗是以反向疫苗學(xué)理論為基礎(chǔ),將多個抗原表位基因以適當(dāng)?shù)姆绞酱?lián)

5、后重組至真核表達(dá)載體而制成。它可同時攜帶多個相關(guān)的抗原表位,包含信息量大,在應(yīng)對血清型多、變異快的病毒病方面有著極大的優(yōu)勢,是基因工程蛋白質(zhì)疫苗、核酸疫苗及抗體疫苗等新形式的分子疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。在篩選策略上,人們建立了人工預(yù)測法來提高抗原表位的篩選及鑒定效率。借助于計算機編制的預(yù)測軟件,能夠精確地預(yù)測抗原表位,減少盲目性,提高實驗的成功率,已在多種病毒疫苗開發(fā)研制中取得了成功。
　　 已知與HFRS相關(guān)的HV亞型有四種:HTN

6、V、SEOV、普馬拉病毒(puumalavirus,PUUV)和多布拉伐病毒(dobrav virus,DOBV)。中國境內(nèi)已發(fā)現(xiàn)HTNV、SEOV、PUUV等三種亞型,其中HTNV、SEOV是我國HFRS的主要病原體,變異較快,我國大部分地區(qū)為這兩型病毒混合型感染區(qū);PUUV以往只流行于歐洲部分地區(qū),近年來在吉林省撫松地區(qū)棕背鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn),具有潛在的流行趨勢。
　　 本研究采用生物信息學(xué)軟件對HTNV、SEOV、PUUV包膜糖蛋

7、白G2的抗原表位進(jìn)行了分析和預(yù)測,共篩選出T細(xì)胞和B細(xì)胞表位25段。將這些表位串聯(lián)在一起構(gòu)成多表位嵌合基因——HSP基因。在設(shè)計多表位HSP基因的同時引入了免疫刺激序列CpG(GACGTT),以進(jìn)一步提高其免疫活性。將HSP基因插入真核表達(dá)載體構(gòu)建了HSP多表位DNA疫苗pcDNA3.1-HSP,然后通過體內(nèi)和體外實驗來檢測其抗原性和免疫活性。為進(jìn)一步探尋HSP多表位疫苗的最佳免疫效果,我們還設(shè)計了蛋白疫苗和DNA疫苗聯(lián)合免疫的策略,期

8、望找到一個更好的免疫方式,使疫苗的免疫效果達(dá)到最佳。鑒于有學(xué)者擔(dān)心DNA疫苗有整合到宿主細(xì)胞染色體的安全性問題,我們對HSP多表位疫苗在動物體內(nèi)的分布及其整合安全性進(jìn)行了分析。
　　 方法：
　　 一、HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2抗原表位預(yù)測及HSP基因的設(shè)計與合成
　　 (一)預(yù)測HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2抗原表位
　　 采用在線預(yù)測網(wǎng)站Bcepred(http://www

9、.imtech.res.in/raghava/bcepred/)、Expasy(http://us.expasy.org/)、ProPred(http:/www.imtech.res.in/)及IEDB AnalysisResource對HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2的抗原表位進(jìn)行分析和預(yù)測。
　　 (二)HSP基因的設(shè)計
　　 用柔性肽作為Linker串聯(lián)各抗原表位,根據(jù)遺傳中心法則將氨基酸序列轉(zhuǎn)化為基因序

10、列,在基因兩端加入起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)、免疫刺激序列CpG(GACGTT)及酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ,構(gòu)建成線性的多表位嵌合基因——HSP基因。
　　 (三)HSP多表位基因所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析
　　 采用DNASTAR、PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES生物軟件及在線預(yù)測網(wǎng)站Expasy(http://us.expasy.org/)對HSP多表位基因所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)及

11、親水性、柔性、抗原性、表面可及性進(jìn)行分析。
　　 二、化學(xué)人工合成HSP多表位嵌合基因
　　 由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司化學(xué)人工合成HSP基因并構(gòu)建質(zhì)粒pET32α-HSP,采用酶切法和測序方法鑒定合成序列的正確性。
　　 三、HSP多表位基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析
　　 (一)pGEX6p-1-HSP原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pET32

12、α-HSP及pGEX6p-1質(zhì)粒,回收HSP基因和開環(huán)的pGEX6p-1質(zhì)粒。用T4連接酶將二者連接,構(gòu)建pGEX6p-1-HSP原核表達(dá)載體,EcoRV/PstⅠ雙酶切鑒定。
　　 (二)pGEX6p-1-HSP表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析
　　 原核表達(dá)pGEX6p-1-HSP重組蛋白,常規(guī)方法SDS-PAGE電泳,以多克隆兔免疫血清和恢復(fù)期HFRS病人陽性血清為一抗分別進(jìn)行Western-blotting,分析其抗原性。<

13、br>　　 四、HSP多表位基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時表達(dá)
　　 (一)pcDNA3.1-HSP真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pET32α-HSP及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,回收HSP基因和開環(huán)的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。用T4連接酶將二者連接,構(gòu)建pcDNA3.1-HSP真核表達(dá)載體,PstⅠ酶切鑒定。
　　 (二)pcDNA3.1-HSP轉(zhuǎn)染vero-E6細(xì)胞
　　 真核

14、表達(dá)載體pcDNA3.1-HSP以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染vero-E6細(xì)胞。
　　 (三)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR檢測
　　 提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　 (四)表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測
　　 間接免疫熒光檢測表達(dá)產(chǎn)物,以1:160稀釋兔抗-HSP多克隆免疫血清和1:80恢復(fù)期H

15、FRS病人血清為一抗。
　　 五、HSP多表位DNA疫苗免疫活性的研究
　　 (一)動物免疫方案
　　 Balb/c純系小白鼠每組各30只,采用0d、14d、28d3針免疫程序。每次免疫前24 h在小鼠股四頭肌肌注0.75％布比卡因10μL。HSP多表位DNA疫苗100μg、HSP重組蛋白50μg免疫小鼠。免疫后定期對小鼠采血分離血清,取脾、心、肝、腎、注射局部肌肉組織,-20℃2保存。分組情況如下:
　　

16、 (二)ELISA法檢測免疫鼠血清IgG抗體及細(xì)胞因子
　　 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測免疫鼠血清細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon gamma,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)與IgG抗體及亞型IgG1、IgG2a的水平。
　　 (三)MT

17、T法檢測免疫鼠脾淋巴細(xì)胞增殖
　　 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法檢測免疫鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。
　　 六、HSP多表位DNA疫苗的分布及基因組整合安全性檢測
　　 (一)HSP多表位DNA疫苗的分布檢測
　　 設(shè)計引物3對,分別覆蓋HSP基因的前、中

18、、后三部分,以確保檢測準(zhǔn)確性。PCR法檢測HSP多表位DNA疫苗在免疫鼠體內(nèi)分布情況。
　　 (二)HSP多表位DNA疫苗與小鼠基因組整合安全性檢測
　　 以1％瓊脂糖凝膠電泳純化小鼠基因組DNA,按上述分布檢測的反應(yīng)條件及引物進(jìn)行PCR擴增,檢測DNA疫苗基因是否與小鼠細(xì)胞基因組發(fā)生整合。
　　 結(jié)果：
　　 一、抗原表位預(yù)測結(jié)果及HSP基因合成
　　 篩選HNTV、SEOV、PUUV包膜糖蛋白

19、G2的抗原表位25個,以柔性肽作為Linker串聯(lián)起來,在基因兩端加入起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)、免疫刺激序列CpG(GACGTT)及酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ,構(gòu)建成HSP嵌合基因,全長1542 bp,由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司化學(xué)人工合成。酶切及測序鑒定結(jié)果與設(shè)計完全相符
　　 二、HSP多表位基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征分析
　　 采用生物信息學(xué)軟件分析HSP多表位基因編碼蛋白質(zhì),親水性和獨立抗原

20、區(qū)域較多,柔性區(qū)域分布廣,二級結(jié)構(gòu)中β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲共占58.94％。
　　 三、HSP多表位基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析
　　 (一)原核表達(dá)載體pGEX6p-1-HSP的鑒定
　　 原核表達(dá)載體pGEX6p-1-HSP經(jīng)PstⅠ/EcoRⅤ雙酶切后產(chǎn)生三個片段,分別為2.9kb、2.2kb、1.4kb,與預(yù)期結(jié)果完全相符。
　　 (二)原核表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析
　　 原核表達(dá)產(chǎn)物

21、HSP重組蛋白可分別與多克隆兔免疫血清和恢復(fù)期HFRS病人陽性血清發(fā)生反應(yīng),有74kD蛋白條帶,表明具有較好的抗原性。
　　 四、HSP多表位基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時表達(dá)
　　 (一)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HSP的鑒定
　　 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HSP經(jīng)PstⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段,分別為5.1kb、1.7kb,與預(yù)期結(jié)果完全相符。
　　 (二)瞬時表達(dá)
　　 RT-PCR及間

22、接免疫熒光檢測pcDNA3.1-HSP可在vero-E6細(xì)胞中瞬時表達(dá)。
　　 五、HSP多表位DNA疫苗免疫活性的研究
　　 HSP多表位DNA疫苗組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平與淋巴細(xì)胞增殖活性高于對照組(P＜0.01);IgG特異性抗體高于對照組(P＜0.01),分型檢測IgG1、IgG2a均升高,IgG2a水平高于IgG1。
　　 六、HSP多表位DNA疫苗與HSP重組蛋白聯(lián)合免疫方案評價

23、
　　 DDH組經(jīng)蛋白加強免疫后細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平及IgG水平、淋巴細(xì)胞增殖活性高于HHD組、DDD組和HHH組(P＜0.05)。IgG抗體分型檢測,DDD組和DDH組IgG2a水平高于IgG1(P＜0.01),HHH組和HHD組IgG1水平高于IgG2a(P＜0.01)。
　　 七、HSP多表位DNA疫苗的分布及整合安全性檢測
　　 HSP多表位DNA疫苗在小鼠體內(nèi)持續(xù)分布達(dá)到60d以

24、上,未檢測到DNA疫苗與小鼠基因組DNA有整合的現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 1、篩選出HTNV、SEOV、PUUV包膜糖蛋白G2的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位25個,設(shè)計構(gòu)建了HSP多表位嵌合基因并采用化學(xué)人工合成;
　　 2、生物信息學(xué)軟件分析HSP多表位基因編碼蛋白親水性和獨立抗原區(qū)域較多,柔性區(qū)域及表面可及性區(qū)域分布廣,二級結(jié)構(gòu)中β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲共占58.94％;
　　 3、構(gòu)建了HSP多表位基因的原核表達(dá)

25、載體pGEX-6p-1-HSP,表達(dá)并純化了HSP重組蛋白,Western-blotting分析具有良好的抗原性。
　　 4、構(gòu)建了HSP多表位基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HSP,并在哺乳動物細(xì)胞veto-E6中進(jìn)行瞬時表達(dá);
　　 5、動物免疫實驗表明HSP多表位DNA疫苗能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫,以細(xì)胞免疫為主,具有良好的免疫活性;
　　 6、HSP多表位DNA疫苗在小鼠體內(nèi)持續(xù)分布達(dá)到60d以上,