流感病毒DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果的初步研究.pdf

1、流感是一個(gè)古老且第一個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的病毒性急性呼吸道傳染病。流感危害極為嚴(yán)重，流行時(shí)波及面廣，有很高的超額死亡率，對(duì)人群健康、甚至對(duì)社會(huì)穩(wěn)定產(chǎn)生重大影響，對(duì)經(jīng)濟(jì)造成難以估計(jì)的損失。 流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxovirdae)，是一種負(fù)鏈RNA病毒，病毒基因組為單股8節(jié)段負(fù)鏈RNA。流感病毒最大的特點(diǎn)是容易變異，以逃避人體的免疫力，這也是流感不斷發(fā)生流行而不能根除的原因。疫苗免疫仍是當(dāng)今預(yù)防流感最有效的手段。

2、 近年來(lái)，由于DNA疫苗能誘導(dǎo)出較好的體液免疫和細(xì)胞免疫而日益受到重視，被譽(yù)為疫苗的第三次革命。本研究選用H1N1流感病毒A/PR/8/34株表面的兩個(gè)糖蛋白血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA和病毒核殼體內(nèi)部的NP蛋白的編碼基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行流感DNA疫苗的研究。提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增出HA、NA和NP片段，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1/HA、pVAX1/NA和pVAX1/NP。利用重疊延伸PCR的方法，在成功構(gòu)

3、建的pVAX1/HA、pVAX1/NA DNA疫苗基礎(chǔ)上，將HA1及NA胞外區(qū)通過(guò)柔性氨基酸接頭連接起來(lái)，構(gòu)建成融合表達(dá)的雙分子DNA疫苗。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，免疫組化方法和Western blot方法檢測(cè)目的基因在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。 將重組質(zhì)粒以100μg/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠，隔周免疫一次，加強(qiáng)免疫3次，檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫的指標(biāo)。結(jié)果顯示，單分子的HA、NA和NP DNA疫苗初次免疫后能檢

4、測(cè)到血清總的IgG抗體水平，加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著升高，抗體亞型及免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果顯示，三個(gè)分子的DNA疫苗誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明我們所構(gòu)建的DNA疫苗具有較好的免疫保護(hù)性。 EuSA檢測(cè)雙分子DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體、IgG抗體亞類(lèi)，流式細(xì)胞儀分析免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，結(jié)果證明雙分子DNA疫苗能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異的體液免疫應(yīng)答，也能夠誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，但其抗體水平