流感病毒為載體的HCV疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、目的：隨著醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，直接抗病毒藥物得到了開發(fā)應(yīng)用，丙型肝炎的治療得到了改善，但是控制疾病傳播最有效的方式仍然是研發(fā)出針對性疫苗。HCV疫苗的研發(fā)一直在進(jìn)行，但是到目前為止仍沒有一個有效的HCV疫苗研制出來。本文旨在以流感病毒為載體嵌合HCV E1基因構(gòu)建和拯救候選疫苗株，并對其進(jìn)行免疫評價。
　　方法：以流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)為載體，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)將HCV結(jié)構(gòu)蛋白E1基因插入到PR8流感病

2、毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS基因中，構(gòu)建重組質(zhì)粒rNS-E1，鑒定成功后將重組質(zhì)粒rNS-E1與PR8流感病毒另外7個質(zhì)粒（分別為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M）共同轉(zhuǎn)染進(jìn)COSⅠ和MDCK細(xì)胞中，拯救以流感病毒為載體嵌合HCV E1基因的候選疫苗株，通過血凝試驗（HA）、RT-PCR、PCR、Western blotting（WB）、透射電鏡等方法對重組病毒FLU-HCV進(jìn)行鑒定。將重組病毒rFLU-HCV/E1在9日齡SPF雞胚上進(jìn)

3、行擴(kuò)增、超濾濃縮、30％-60%蔗糖密度梯度純化，得到重組病毒液。設(shè)置104TCID50、105TCID50、106TCID50三個劑量組，并設(shè)PBS對照組，按20μL/只滴鼻免疫BALB/c雌鼠，分0d、14d免疫兩次，0d、14d和28d收集小鼠血清和脾淋巴細(xì)胞懸液，初步評價其免疫效果。
　　結(jié)果：成功拯救HCV疫苗候選株rFLU-HCV/E1，血凝初檢效價（HA）為29-10，每1mL rFLU-HCV/E1病毒液含有1×1

4、06.5TCID50單位，其抗原蛋白含量為1.6mg/mL。滴鼻免疫Balb/c小鼠二免后14d取小鼠血清及脾淋巴細(xì)胞，測得針對重組病毒rFLU-HCV/E1的血凝抑制（HI）效價均值分別為80、640和1280，疫苗株在小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生針對PR8流感病毒的體液免疫，產(chǎn)生針對E1多肽表位的細(xì)胞免疫，與PBS對照組相比差異明顯（p<0.001），且106TCID50組免疫效果優(yōu)于104TCID50劑量組和105TCID50劑量組，初步證明重