以HBcAg為載體的胃癌疫苗的構(gòu)建、表達(dá)、純化及免疫研究.pdf

1、本試驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因克隆方法構(gòu)建pET-21A/MIR/MAGE-A3串聯(lián)表位重組質(zhì)粒，探索其在原核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)并鑒定，并將它們合成的蛋白通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫兩個(gè)方向進(jìn)行免疫研究。以期能合成用于胃癌臨床試驗(yàn)的免疫性疫苗。
　　目的:
　　[1]以pET-21a/MIR為載體，構(gòu)建含MAGE-A3串聯(lián)表位基因的重組質(zhì)粒并鑒定;
　　[2]重組質(zhì)粒pET-21a/MIR-MAGE-A3串聯(lián)表位的蛋白表

2、達(dá)及鑒定;
　　[3]研究pET-21a/MIR-MAGE-A3串聯(lián)表位蛋白的免疫原性。
　　方法:
　　[1]通過(guò)PCR擴(kuò)增出MAGE-A3表位基因，插入到載體HBc的MIR區(qū)，構(gòu)建3個(gè)重組質(zhì)粒即pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352、pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353(重

3、組質(zhì)粒表達(dá)蛋白分別稱(chēng)為MIR-ozlf-351'、MIR-ozlf(351'+352)、MIR-ozlf(351'+352+353))。經(jīng)PCR鑒定、DNA測(cè)序驗(yàn)證正確后，將3個(gè)重組質(zhì)粒及pET21a/HBc(MIR)（質(zhì)粒表達(dá)蛋白簡(jiǎn)稱(chēng)MIR）轉(zhuǎn)化入BL21菌株中，IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA層析法純化，然后進(jìn)行WB檢測(cè)鑒定表達(dá)蛋白;
　　[2]選取6～8周的BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分為6組，分別為CTL合成肽、M

4、IR-ozlf-351'、MIR-ozlf351'/352/353組，PBS和MIR組為陰性對(duì)照，全長(zhǎng)MAGE-A3表達(dá)蛋白組為陽(yáng)性對(duì)照，每組7只。分別在1、3、5w時(shí)，皮下多點(diǎn)注射免疫，免疫3次;0w、2w、4w、6w、8w時(shí)斷尾取血并分離血清，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)分別檢測(cè)特異性IgG和IgA。末次免疫后2w，用CTL合成肽孵育小鼠脾細(xì)胞:以P815細(xì)胞為靶細(xì)胞，LDH法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CTL的殺傷活性。
　　結(jié)果:<

5、br>　　[1]成功構(gòu)建了含表位基因的重組質(zhì)粒pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352pET21 a/HBcAg(MIR)-ozlf-351/'ozlf-352/ozlf-353,MIR-ozlf-351'、MIR-ozlf(351'+352+353)及MIR蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，WB證實(shí)獲得了純化的目的蛋白;
　　[2]免疫原

6、性檢測(cè):
　　體液免疫:ELISA檢測(cè)免疫前后各組小鼠血清中目的蛋白特異性IgG抗體水平，用吸光度值來(lái)表示。當(dāng)小鼠血清稀釋度為1∶100時(shí)，ELISA結(jié)果顯示:各組小鼠IgG抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加，在第4W開(kāi)始升高，第6W達(dá)到高峰。重組蛋白MIR-ozlf-351'組IgG抗體水平(0.433±0.025)較重組蛋白MIR-ozlf-351'/ozl f-352/ozlf-353(0.281±0.029)高，全長(zhǎng)蛋白MAGE-

7、A3組IgG抗體水平最高(0.988±0.023)，而重組蛋白MIR-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353IgG抗體水平相對(duì)較低，PBS組為(0.147±0.008)。
　　細(xì)胞免疫:LDH法檢測(cè)CTL的殺傷靶細(xì)胞作用，殺傷率計(jì)算結(jié)果顯示:1）各組蛋白在效靶比為40∶1時(shí)殺傷率最高;2）效靶比為40∶1和20∶1時(shí)，一表位、三表位組的殺傷率相對(duì)MAGE-A3組要低;3）效靶比為10∶1時(shí)，三表位組殺傷率明顯升高，

8、高于一表位和MAGE-A3組的殺傷率。
　　結(jié)論:
　　[1]成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'、pET21a/HBcAg(MIR)-ozl f-351'/ozlf-352、 pET21a/HBcAg(MIR)-ozlf-351'/ozlf-352/ozlf-353，原核表達(dá)蛋白量尚可;
　　[2] HBcAg(MIR)-MAGE-A3串聯(lián)表位蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生MAGE-A3特異性的