VEZT在胃癌組織中的表達及其過表達載體構(gòu)建.pdf

1、目的：胃癌是多年來一直影響著人類身心健康的惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)處于腫瘤的第四位，死亡率已處于癌癥的第二位。胃癌的發(fā)生是多個基因突變的結(jié)果，是一個多階段、多種影響因素的復(fù)雜過程。多年來，許多學(xué)者在胃癌的發(fā)生機制及預(yù)后方面做了大量研究，但是目前其發(fā)生機制尚未完全闡明，且沒有一個指標(biāo)能較好地預(yù)測胃癌患者的生存期。其中，抑癌基因表達的下調(diào)是胃癌發(fā)生的一個重要原因，因此上調(diào)抑癌基因的表達為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供了一個重要思路。V

2、EZT基因是本課題組新近發(fā)現(xiàn)的胃癌相關(guān)候選抑癌基因，其編碼的蛋白是一種跨膜蛋白，包括三部分，即較短的膜外部、跨膜部和較長的膜內(nèi)部，其中膜內(nèi)部與肌球蛋白Ⅶa(myosinⅦa)相連。肌球蛋白Ⅶa及其配體VEZT蛋白共同定位粘合連接于E-鈣粘蛋白上，發(fā)揮類似于E-鈣粘蛋白的作用，具有增加上皮細(xì)胞間相互粘附的作用，對保證上皮組織極性和完整性也具有重要作用。本課題組在前期的研究工作中，利用QRT-PCR技術(shù)在體外培養(yǎng)的5種胃癌細(xì)胞系及術(shù)后胃癌組

3、織標(biāo)本中均檢測到VEZT基因的mRNA表達水平比在正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及癌旁正常胃粘膜組織標(biāo)本中低。該研究結(jié)果表明，VEZT基因有作為胃癌相關(guān)候選抑癌基因的潛力，有望成為潛在的抗腫瘤治療靶點之一。但是，VEZT基因在胃癌細(xì)胞中的定位，與胃癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系尚未完全闡明。因此，本研究對VEZT蛋白和E-鈣粘蛋白在胃癌細(xì)胞中進行了定位，探討了VEZT蛋白在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達，并分析了其與患者臨床病理特征及預(yù)

4、后的關(guān)系。為了更加深入的了解VEZT在胃癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，我們將VEZT基因克隆入pEGFP-N1構(gòu)建其過表達載體，為進一步深入研究VEZT在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程及治療中的作用提供基礎(chǔ)。
　　方法：通過免疫熒光技術(shù)對VEZT蛋白和E-鈣粘蛋白在SGC-7901胃癌細(xì)胞中進行了定位，采用免疫組織化學(xué)法檢測119例術(shù)后胃癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)癌旁正常組織中VEZT蛋白的表達，并分析其與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。從人腎小管上皮

5、293T細(xì)胞中提取總RNA，利用PCR方法擴增出VEZT基因片段，經(jīng)酶切、純化，利用DNA重組技術(shù)將目的基因片段VEZT連接于pEGFP-N1真核表達載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，分別用酶切、1.0％瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序、對比分析等對重組質(zhì)粒載體進行鑒定。
　　結(jié)果：⑴VEZT蛋白主要表達于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，E-鈣粘蛋白主要表達于胃癌細(xì)胞膜上，兩者有部分重疊。⑵胃癌組織標(biāo)本中VEZT的陽性表達率為30.25％，顯著低于

6、相應(yīng)癌旁正常組織中VEZT的陽性表達率60.50％(P＜0.05)。⑶胃癌組織標(biāo)本中VEZT的陽性表達率與胃癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(均P＜0.05)，而與患者的年齡、腫瘤大小無相關(guān)性(均P＞0.05)。⑷單因素生存分析顯示VEZT的表達與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)。⑸酶切電泳分析得到的目的片段，大小與理論值一致，DNA測序、對比證實目的基因序列無突變。
　　結(jié)論：①VEZT蛋白主要表達于細(xì)胞膜及細(xì)胞