COX-2過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HSCs中的表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建COX-2過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至HSC-T6中觀察其表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究 COX-2與HSC生物學(xué)功能的關(guān)系提供前期準(zhǔn)備。
　　方法：1.調(diào)取 COX-2鼠源全長(zhǎng)基因，TRIzol法抽提大鼠肝總 mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA建立文庫(kù)。
　　2.用RT-PCR擴(kuò)增得到COX-2目的片段，PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒雙酶切處理后將 COX-2基因片段連接至pcDNA3.1(+)載體上，將構(gòu)建成的pcDNA3.1

2、(+)-rCOX-2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含50μg/ml Kana LB固體平皿上篩選陽(yáng)性克隆菌株。
　　3.篩選后再對(duì)pcDNA3.1(+)-rCOX-2進(jìn)行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定和測(cè)序的分析。
　　4.將構(gòu)建成功的pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入HSC-T6細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：HSC-T6細(xì)胞組（空白組），pcDNA3.1(+)-rCOX-2組（COX-2過(guò)表達(dá)組）；pcD

3、NA3.1（+）組（空載體組）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)表達(dá)載體在HSC-T6中COX-2 mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.RT-PCR產(chǎn)物顯示在1800 bp左右出現(xiàn)目的條帶。
　　2.將所得的目的基因酶切鑒定及序列分析，測(cè)序結(jié)果表明和GenBank的COX-2基因序列一致，pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　3. pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入