HCBP6基因過表達(dá)載體和RNAi載體的構(gòu)建及其功能學(xué)研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus）是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一，在全世界范圍內(nèi)感染HCV的數(shù)據(jù)是1.7億。70-80％的丙肝病毒感染是持久感染并且這其中30％的持久感染患者最終將發(fā)展成為慢性肝臟疾病，包括肝硬化，肝細(xì)胞癌等。全世界每年約有250,000～350,000人死于HCV 相關(guān)終末期肝病、肝硬化及肝癌，對患者的健康和生命危害極大，早已成為嚴(yán)重的社會與公共衛(wèi)生方面的問題，但目前我們針對HCV 感染的治

2、療手段十分有限，目前主要的治療手段是干擾素加利巴韋林，但是效果不佳，而且不能用于肝硬化失代償期的患者。
　　 更令人遺憾的是，迄今為止，還沒有任何一個(gè)國家研究出可預(yù)防HCV 感染的疫苗[1-3]。所以，進(jìn)一步深入揭示HCV的發(fā)病機(jī)制，探尋HCV 致病的分子生物學(xué)機(jī)制也便成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題之一。
　　 丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein6)是本課

3、題組前期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從肝細(xì)胞Cdna文庫中篩選得到的一種可以與丙型肝炎病毒核心蛋白相結(jié)合的蛋白[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，HCBP6蛋白能夠上調(diào)和下調(diào)一系列不同基因的表達(dá)水平，這些差異表達(dá)的基因與細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增生、分化及生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)。因此，對HCBP6 進(jìn)行更深一步的研究是十分必要的。
　　 前期，我們從轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)入手對HCBP6 進(jìn)行了研究，應(yīng)用相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)對HCBP6基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)

4、行了預(yù)測，并通過缺失等方法進(jìn)一步驗(yàn)證該啟動子活性區(qū)域的存在，還用EMSA （凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)）對該活性區(qū)域以及與該區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 現(xiàn)在我們分別構(gòu)建HCBP6 過表達(dá)和RNAi 載體并且經(jīng)過篩選得到抑制效率高的RNAi 載體，通過劃痕試驗(yàn)來初步證明HCBP6 可能有的功能。
　　 目的
　　 本課題旨在研究HCBP6蛋白在肝癌細(xì)胞系HepG2 增殖過程中發(fā)揮的作用，分別從構(gòu)建過表達(dá)載體和RNAi

5、載體兩個(gè)方面來證明HCBP6蛋白在HepG2細(xì)胞中可能具有的功能，給后續(xù)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)做一個(gè)探索。
　　 方法
　　 1、成功構(gòu)建過表達(dá)載體，在該載體上加入c-myc和His 標(biāo)簽為后續(xù)蛋白純化及篩選識別實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備2、構(gòu)建RNAi 載體，通過熒光顯微鏡來初步判定轉(zhuǎn)染效率，并且提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為Cdna 做ReAlime PCR 來檢測并篩選出抑制效率高的兩個(gè)RNAi 質(zhì)粒。
　　 3、通過初步的功能

6、學(xué)實(shí)驗(yàn)來初步驗(yàn)證HCBP6對于真核肝癌細(xì)胞HepG2 遷移速率的影響，判斷該基因?qū)τ诟伟┘?xì)胞HepG2 遷移，即對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果
　　 1．成功獲得了HCBP6的過表達(dá)載體pcDNA3.11/myc-his(-)-HCBP6。
　　 2．成功獲得HCBP6的含有綠色熒光蛋白的RNAi 載體，且測序證實(shí)插入序列與理論序列一致。試驗(yàn)組的表達(dá)活性與對照組的表達(dá)活性相比降低0.6倍。獲得了具有較高抑制

7、效率的含有HCBP6基因序列的質(zhì)粒。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞在經(jīng)劃痕試驗(yàn)檢測后得到：HCBP6 可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在0-6h 每小時(shí)遷移13 微米，在6-12h 每小時(shí)遷移7 微米，12-24h 每小時(shí)遷移13 微米，而陰性熒光對照組0-6h 每小時(shí)遷移12 微米，6-12h 每小時(shí)遷移5 微米，12-24h 每小時(shí)遷移13 微米，由此獲得實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移速率與對照組相比有加快趨勢。從而初步證明HCBP6基因?qū)τ诟伟┘?xì)