水稻溫敏不育相關(guān)基因RNAi和過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本實驗室于2002年用具有明顯育性轉(zhuǎn)換特征的水稻溫敏核雄性不育系Tb7S為材料，通過抑制性削減雜交(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)技術(shù)篩選減數(shù)分裂期的Tb7S幼穗在高溫可育和低溫不育條件下的差異表達(dá)cDNA片段。經(jīng)SSH富集cDNA片段構(gòu)建了兩個cDNA質(zhì)粒文庫，即Tb7S可育幼穗和不育幼穗的cDNA消減文庫。并從可育幼穗cDNA消減文庫隨機挑取39克隆進行測序，但沒有進行Reverse

2、NorthernDot-blot鑒定。 本研究選取上述39個克隆中的37個克隆進行ReverseNorthernDot-blot鑒定，剔除假陽性后，共獲得11個差異較明顯的陽性克隆。 根據(jù)ReverseNorthernDot-blot鑒定的結(jié)果，選取差異表達(dá)最明顯的基因作為轉(zhuǎn)化水稻的目的基因。將選取基因的序列在水稻全長cDNA數(shù)據(jù)庫進行比對，選取與其他水稻基因連續(xù)相同的堿基數(shù)不超過21個的一段序列作為RNAi干涉片段，并

3、根據(jù)這段序列設(shè)計RNAi引物，克隆這些基因和RNAi片段。測序表明，已經(jīng)成功克隆到RNAi片段RiOs243、RiOs183、RiOs371.、RiOs408和基因Os348、Os371、Os183。 選用pTCK303作為實施RNA干涉和過表達(dá)策略的植物表達(dá)載體，將RNAi片段進行兩次酶切連接，分兩次連接到載體中，第一次正向連入，第二次反向連入，構(gòu)建成RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-RiOs243、pTCK303-RiOs

4、183、pTCK303-RiOs371、pTCK303-RiOs408。將基因Os348、Os371、Os183進行一次酶切連接，連入過表達(dá)載體中，構(gòu)建成過表達(dá)載體pTCK303-Os348、pTCK303-Os371.、pTCK303-Os183。 構(gòu)建完成的RNAi和過表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化水稻，經(jīng)共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化培養(yǎng)后得到6株pTCK303-Os371載體轉(zhuǎn)化的T0代植株。提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，進行PCR檢測