玉米ZmPOT基因TALEN敲除和過表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、容重是一個重要的產(chǎn)量性狀，也是作物超高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)性狀。玉米容重能夠真實地反映玉米的成熟度、完整度、均勻度、籽粒結(jié)構(gòu)緊實度和使用價值，是玉米商品及加工品質(zhì)的重要指標(biāo)，是國際貿(mào)易中質(zhì)量定級的重要因素。長期以來，對玉米品質(zhì)的研究大多集中在如何提高營養(yǎng)價值和加工品質(zhì)上，而忽略了商品品質(zhì)尤其是容重對玉米品質(zhì)的影響。對容重這個復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)研究不夠深入，導(dǎo)致我國玉米容重改良進展緩慢，嚴(yán)重影響了國際市場的競爭力。課題組前期以容重為研究對象，

2、在玉米第7號染色體上定位到一個主效的QTL，該QTL區(qū)段內(nèi)存在一個重要的候選基因，命名為ZmPOT。功能預(yù)測表明該基因編碼POT家族蛋白，是氨基酸進入細胞內(nèi)的關(guān)鍵膜轉(zhuǎn)運蛋白。本研究構(gòu)建了帶有胚乳特異性啟動子GT1的植物過表達載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar以及TALEN敲除ZmPOT基因的載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行玉米幼胚和胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化，以期建立玉米TALEN敲除體系，并利用過表達及敲除技術(shù)研究ZmPOT基因的功能。<

3、br>　　本研究取得如下結(jié)果:
　　1.以B73籽粒總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，克隆了ZmPOT基因。所克隆的ZmPOT序列全長為2084 bp，編碼640個氨基酸，擴增的片段與Gramene數(shù)據(jù)庫公布的該基因序列相似性為100％。
　　2.用In-Fusion法將胚乳特異性啟動子Gt1和目的基因分別連接到pCUB骨架載體上，構(gòu)建了植物表達載體pCUB-GT1-ZmPOT-bar。經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定及表達載體的序列分

4、析表明，表達載體構(gòu)建成功。
　　3.為了保證TALEN敲除的特異性，我們在玉米ZmPOT基因的第二個外顯子上設(shè)計了TALEN左右臂靶點。利用質(zhì)粒文庫試劑盒，將TALEN質(zhì)粒模塊分別構(gòu)建到左右臂骨架載體上。
　　4.分別酶切左右臂骨架載體和pCAMBIA1301植物表達載體，再將TALEN左右臂模塊連接到pCAMBIA1301植物表達載體上，經(jīng)過酶切鑒定及模塊序列分析表明，表達載體構(gòu)建成功。
　　5.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p

5、CUB-GT1-ZmPOT-bar和TALEN敲除載體分別轉(zhuǎn)化玉米幼胚組織和玉米胚性愈傷組織。經(jīng)除草劑草甘膦和潮霉素篩選后得到具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，以幼胚為受體得到過表達載體的T0代抗性植株9株，以愈傷組織為受體得到的TALEN敲除載體T0代抗性植株146株。
　　6.根據(jù)啟動子區(qū)設(shè)計特異引物，經(jīng)PCR檢測過表達載體抗性植株基因組DNA，未得到陽性植株。TALEN敲除載體得到陽性植株15株。
　　7.將TALEN敲除載體得到