CMV和TuMV病毒嵌合基因反向重復表達載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)和蕪菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus，TuMV)是侵染蔬菜類作物的兩種主要病毒，可導致許多蔬菜作物嚴重減產(chǎn)甚至絕收。由于缺乏優(yōu)良的抗源，常規(guī)育種進展非常緩慢，近年來植物基因工程和分子生物學的迅猛發(fā)展為植物抗病毒育種提供了一種有效的途徑。最近的研究表明，將病毒核酸基因片段以反向重復的方式導入植物，其轉(zhuǎn)錄會形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)夾RNA(hairpin RNA，

2、hpRNA)，可有效地引發(fā)基因沉默現(xiàn)象，不但能將轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解同時能使入侵的同源病毒基因組RNA降解，從而獲得對相應病毒的高度抗性和高比率的抗性轉(zhuǎn)基因植株。 本研究首先分析了我國一些CMV分離物的UP的多態(tài)性；然后通過分子克隆的手段將CMV-2b和TuMV-CP基因保守區(qū)域組成病毒嵌合基因，以反向重復方式插入植物雙元表達載體pBI 121中，成功構(gòu)建了RNA干擾表達載體；隨后采用農(nóng)桿菌介導的Floral Dip法轉(zhuǎn)化擬南芥

3、(Arabidopsis thaliana)，以及組織培養(yǎng)途徑轉(zhuǎn)化“四九”菜心(Brassica campestrisL.VSX．Parachinesis)，初步獲得擬南芥、菜心轉(zhuǎn)基因植株，為利用植物抗病毒基因工程培育抗多種病毒的蔬菜作物打下了基礎(chǔ)，主要結(jié)果如下： (1)對來自國內(nèi)不同地區(qū)、不同蔬菜作物8種CMV分離物(BF、BG、BH、BT、CF、GF、JF和SF)CP基因進行了克隆和測序，氨基酸序列同源性比對結(jié)果得出本研究中

4、的8個CMV分離物均屬于CMV亞組I，與先前的血清學鑒定和利用位于RNA2上的2b基因序列進行株系亞組定位的結(jié)果相一致。但是本研究中BF和BG的CP基因序列同源性為92.8﹪，而在BF和BG的2b基因片段(300bp)100﹪同源，說明CMV的CP基因比2b基因具有較高的自然變異。為此后續(xù)研究采用CMV 2b基因來進行。 (2)分別克隆CMV-2b基因保守區(qū)序列片段和TutMV-CP基因保守區(qū)序列片段，組成嵌合病毒基因片段并以反

5、向串聯(lián)重復方式轉(zhuǎn)入到植物雙元表達載體pBI 121，得到CMV和TlJMV雙抗的植物RNAi表達載體pBI TC3，并采用三親融合方法導入農(nóng)桿菌AGLO菌株中。 (3)將植物RNAi表達載體pBI TC3農(nóng)桿菌菌液采用Floral Dip法轉(zhuǎn)化擬南芥，得到56株陽性植株，經(jīng)PCR鑒定證明外源基因成功整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，從而也印證了Floral Dip法轉(zhuǎn)化擬南芥有著快捷、高效和低成本的優(yōu)勢。 (4)利用常規(guī)的農(nóng)桿