水稻OsCPK9基因的表達分析、表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、水稻是重要的的糧食作物,也是分子生物學(xué)研究中的模式作物。由病原菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病(riceblast)是嚴(yán)重影響水稻品質(zhì)和產(chǎn)量的病害之一,頻繁施用農(nóng)藥難以奏效且易帶來環(huán)境污染,而強化抗逆機能,培育高抗品種是解決這些作物病害問題的根本技術(shù)對策。水稻鈣依賴型蛋白激酶(CDPK)基因家族在應(yīng)對多種生物和非生物脅迫中具有重要作用,并已發(fā)現(xiàn)稻瘟病病原菌侵染能特異地誘導(dǎo)水稻CDPK基因家族中一個成員OsCPK9的上

2、調(diào)表達。為明確OsCPK9的功能,本研究對不同抗性水稻品種OsCPK9基因在各種處理下的表達變化及OsCPK9亞細胞定位進行了初步分析;同時構(gòu)建了OsCPK9基因過表達和RNA干擾載體,并進行了水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究,具體研究結(jié)果如下:
　　(1)通過對三種不同抗性材料的水稻品系接種稻瘟病菌和水楊酸(SA),茉莉酸甲酯(MeJA)激素處理,發(fā)現(xiàn)OsCPK9基因參與了SA、MeJA的抗病信號傳導(dǎo)途徑,而且位于抗病信號傳導(dǎo)途徑的上游,對稻

3、瘟病的侵染有早期響應(yīng);
　　(2)利用基因槍轉(zhuǎn)化法,將成功構(gòu)建的用于亞細胞定位的融合蛋白表達載體質(zhì)粒pBI121-OsCPK9-GFP,轉(zhuǎn)入洋蔥內(nèi)表皮細胞中,瞬時表達結(jié)果表明,目的基因表達的蛋白主要定位于細胞核與質(zhì)膜上;
　　(3)成功構(gòu)建了目的基因OsCPK9的過量表達載體pSN1301-OsCPK9,RNAi表達載體pSN1301-RNAi;
　　(4)通過農(nóng)桿菌侵染水稻野生型日本晴愈傷組織法進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化,成功

4、獲得了空載體、過量表達和RNA干擾的轉(zhuǎn)基因株系;
　　(5)通過分子鑒定和GUS組織化學(xué)染色法鑒定,成功獲得了轉(zhuǎn)基因陽性株系:空載體10株、過表達30株和RNAi10株;進一步通過半定量PCR方法獲得OsCPK9基因表達量與野生型基本一致的空載體轉(zhuǎn)基因株系2株,OsCPK9基因表達量較野生型高的過表達株系2株,OsCPK9基因表達量較野生型低的RNAi株系2株。
　　上述研究結(jié)果為深入了解OsCPK9在水稻抗稻瘟病反應(yīng)中的功