小麥葉綠體表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、在植物基因工程研究中,質(zhì)體是繼核轉(zhuǎn)化之后又一新的遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)受體.質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系具有可同時(shí)進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化;細(xì)菌的基因和很有應(yīng)用價(jià)值的人類的cDNAs可以不經(jīng)過密碼子的修飾或重新合成而直接表達(dá);外源基因表達(dá)水平高;后代遺傳穩(wěn)定;定點(diǎn)整合,不會(huì)產(chǎn)生基因沉默及母性遺傳,安全性好等優(yōu)點(diǎn).目前,葉綠體轉(zhuǎn)化已在煙草、擬南芥菜、馬鈴薯、番茄和油菜(Brassica napus和Lesquerella fendleri)等少數(shù)幾種雙子葉植物中獲得了成功

2、.而單子葉植物,僅在水稻中獲得了轉(zhuǎn)化植株,但葉綠體基因組沒有達(dá)到同質(zhì)化.小麥的葉綠體轉(zhuǎn)化研究雖然有研究,但未構(gòu)建定點(diǎn)整合表達(dá)載體,僅僅實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá).該實(shí)驗(yàn)通過分析小麥葉綠體基因組全序列(GenBank AccessionNo.AB042240),首次選定了rbcL和psaⅠ基因間隔區(qū)作為外源基因的定點(diǎn)整合位點(diǎn).用引物1和2擴(kuò)增包括rbcL基因的3'端部分的約1.0kb的DNA片段,位置從基因組全序列的55744~56767,長(zhǎng)度為10

3、42bp,以該DNA片段作為同源重組片段1;用引物3和引物4擴(kuò)增包括完整的psaⅠ和ycf4這兩個(gè)基因在內(nèi)的約1.5kb的DNA片段,位置從基因組全序列的56788~58284,長(zhǎng)度為1515 bp,以該DNA片段作為同源重組片段2;以煙草葉綠體基因的啟動(dòng)子Prrn和終止子psbA3'控制外源基因的轉(zhuǎn)錄;分別構(gòu)建了包含gfp報(bào)告基因和分別含有篩選標(biāo)記aadA、nptⅡ和betA基因的小麥葉綠體基因組定點(diǎn)整合表達(dá)載體pRAGY,pRNGY

4、和pRCGY.由于葉綠體的原核性質(zhì),所構(gòu)建的載體首先在大腸桿菌中檢測(cè)其有效性.當(dāng)用這些載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,通過激光掃描共聚焦顯微鏡和普通熒光顯微鏡均檢測(cè)到了構(gòu)建在表達(dá)載體中的gfp基因在大腸桿菌中表達(dá)所發(fā)出的強(qiáng)烈的綠色熒光,這表明構(gòu)建在表達(dá)載體中的外源基因在具有原核性質(zhì)的葉綠體中已實(shí)現(xiàn)成功表達(dá).用基因槍轟擊法將小麥葉綠體表達(dá)載體pRNGY導(dǎo)入小麥核生3號(hào)的愈傷組織;轟擊過的材料在MB<,2>繼代培養(yǎng)基上先恢復(fù)培養(yǎng)一周,然后轉(zhuǎn)到添加了