棉花葉綠體轉化載體的構建以及轉化體系的建立.pdf

1、通過細胞核遺傳工程的研究，對棉花產量提高和品質改進以及抗病蟲害起到了積極作用，但細胞核遺傳工程仍存在諸如基因失活、基因沉默、位置效應、花粉漂移及多基因轉化困難等弊端，而葉綠體轉化技術作為一種新興的遺傳轉化技術有望克服核基因轉化帶來的諸多不足，該技術的成功應用將會給棉花基因工程帶來一次新的革命。為了解決棉花細胞核遺傳工程所帶來的諸多問題，開展了棉花葉綠體轉基因的研究，構建棉花葉綠體轉化載體；嘗試建立棉花葉綠體轉化的標準程序。
　　

2、 根據已發(fā)表的棉花葉綠體基因組序列（NC_007944）設計引物，用PCR方法擴增獲得兩段同源序列LHRR和RHRR，并通過酶切連接與質粒pBluesript SK連接構建出載體pBSKRR；同時用PCR方法擴增報告基因gfp及篩選標記nptⅡ基因，并在這兩個基因兩端分別加上來自于棉花葉綠體基因組的強啟動子Prrn和PpsbA以及起穩(wěn)定作用的3’UTR莖環(huán)結構Trps16和TpsbA，構建出含有Prrn-gfp-Trps16和PpsbA

3、-nptⅡ-TpsbA表達盒的載體pGGPT和pGNPT；再將這兩個基因表達盒與載體pBSKRR酶切連接構建出載體pBRGN，并初步應用于棉花和煙草的葉綠體轉化，獲得了具有卡那霉素抗性的煙草的綠色愈傷及幼苗，PCR檢測出gfp基因和nptⅡ基因的條帶，并在熒光顯微鏡下檢測到gfp的表達。gfp在棉花胚性愈傷中也有少量表達，但表達情況很不理想，需要對轉化受體以及再生條件進行進一步的摸索。
　　 盡管葉綠體轉化在棉花中還存在著很多問