杜氏鹽藻完整葉綠體的分離和葉綠體轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因研究的不斷深入，人們將越來越多的研究興趣集中在生長迅速，培養(yǎng)簡單的單細(xì)胞綠藻上。利用單細(xì)胞綠藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化有其優(yōu)越性，與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵、動物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物等轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比，它不需要昂貴的設(shè)備和嚴(yán)格的培養(yǎng)條件，具有光合自養(yǎng)、培養(yǎng)成本低，易于轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，是一類比較廉價和安全的生物反應(yīng)器。 目前，對單細(xì)胞綠藻的轉(zhuǎn)化工作主要集中在兩大方向：細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和葉綠體轉(zhuǎn)化。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，植物的核轉(zhuǎn)化技術(shù)日臻成熟并得到了廣泛的應(yīng)用，

2、但是核基因組的遺傳轉(zhuǎn)化仍存在一系列至今尚未解決的內(nèi)在問題：如由于核基因組大、背景復(fù)雜、易出現(xiàn)基因失活、基因沉默、位置效應(yīng)等現(xiàn)象；所表達(dá)的原核基因必須經(jīng)過修飾改造，環(huán)境安全難以保證等。 而在葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中卻可以克服這些困難。與核轉(zhuǎn)化相比，葉綠體基因組小，遺傳操作簡單，外源基因是通過同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組。定點(diǎn)整合有利于人為控制外源基因的插入位點(diǎn)，可以將目的基因定位在適于表達(dá)的位點(diǎn)，能較好地解決“順式失活”、“位置效應(yīng)

3、”等類的基因沉默問題。由于葉綠體中DNA分子有多個拷貝，同時葉綠體對表達(dá)產(chǎn)物的積累有較強(qiáng)的承受能力，保障了外源基因在葉綠體中的高效表達(dá)。另外，由于葉綠體基因組的原核性質(zhì)，對來自原核生物的外源基因無需改造就可以在葉綠體內(nèi)高效表達(dá)，而且可以將多個外源基因采取“多順反子”的原核表達(dá)形式同時引入，并由共同的啟動子控制，既方便操作又可避免由于存在多個相同啟動子所帶來的“共沉默”。這是核基因轉(zhuǎn)化無法做到的。杜氏鹽藻(以下簡稱鹽藻)是一種低等的單細(xì)胞

4、真核綠藻，屬綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目，進(jìn)化樹分析顯示其與具有細(xì)胞壁的萊茵衣藻十分相似，沒有細(xì)胞壁，長約6-15岬，呈橢圓形或梨形，能依靠其雙鞭毛在水中游動。光鏡下可明顯看到其內(nèi)含一個大型的杯狀葉綠體，約占細(xì)胞總體積的50％?？稍?.05M-5.5M的鹽水中生長，最佳生長繁殖鹽度為2M-3M，目前已知最耐鹽的真核生物。由于鹽藻可在高滲鹽溶液中生長，這是許多其它生物難以生存的環(huán)境，故其大規(guī)模培養(yǎng)不需昂貴的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置，可以直接采用開放式培

5、養(yǎng)，大大降低生產(chǎn)成本，由于沒有細(xì)胞壁可很容易的用基因槍，電擊法等一系列轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，這些獨(dú)特使得杜氏鹽藻可被開發(fā)為一種生產(chǎn)藥用蛋白的良好宿主。 基于葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)越性以及鹽藻的獨(dú)特性，本實(shí)驗(yàn)意欲在鹽藻中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的葉綠體轉(zhuǎn)化。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中，初步的鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建成功，但是由于用于重組的同源片段長度不足使得得到的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不太穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)首先分離大量完整的葉綠體，進(jìn)而抽提高純度葉綠體DNA(cpDNA)，利

6、用四個平端酶隨機(jī)切割cpDNA并連上特異設(shè)計的接頭(Linker)，構(gòu)建四個葉綠體基因組步行文庫，通過巢式PCR擴(kuò)增到足夠長度的同源片段，進(jìn)而構(gòu)建葉綠體轉(zhuǎn)化載體。 實(shí)驗(yàn)方法 1．鹽藻完整葉綠體的分離及cpDNA的提取在進(jìn)行鹽藻葉綠體的分離時，從某種程度上講對其大量高效的培養(yǎng)顯得至關(guān)重要。合適的培養(yǎng)條件一方面可以使細(xì)胞快速增殖，另一方面則可以保持整個生長過程中葉綠體保持良好的形態(tài)。我們在比較了不同的鹽藻生長的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上

7、，對UTEX液體培養(yǎng)液進(jìn)行了部分改良，如將NaCl的濃度調(diào)至1M。 取對數(shù)生長后期的杜氏鹽藻細(xì)胞進(jìn)行高壓破碎，利用差速離心和蔗糖密度梯度離心得到完整的葉綠體。采用優(yōu)化的SDS-proteinase K-酚/氯仿/異戊醇方案抽提得到高純度的cpDNA。 2．鹽藻chiN基因未知側(cè)翼區(qū)的擴(kuò)增chlN被選擇用于我們進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的同源片段。它和chlL、chlB參與編碼光非依賴性的原葉綠素酸醋還原酶(DPOR)，任何一個基因的

8、破壞都阻斷黑暗條件下葉綠素的合成。chlL基因插入失活后，鹽藻還可通過光依賴性的原葉綠素酸醋還原酶系統(tǒng)(LPOR)完成葉綠素的合成，而不影響轉(zhuǎn)化藻的正常生存。 2.1鹽藻葉綠體基因組步行文庫的構(gòu)建將抽提得到的高純度cpDNA分別用Dra I、EcoR V、Pvu Ⅱ和Stu I四個平端限制酶切，之后和特異的接頭連接制成葉綠體基因組步行文庫，作為巢式PCR擴(kuò)增的模板。 2．2chlN基因未知上游側(cè)翼的擴(kuò)增通過在chiN基因上游設(shè)計

9、特異引物，在制成的葉綠體基因組步行文庫中進(jìn)行chiN基因未知上游的擴(kuò)增。 2.3chlN基因未知下游側(cè)翼的擴(kuò)增同樣，通過在chiN基因下游設(shè)計特異引物，在葉綠體基因組步行文庫中進(jìn)行chiN基因未知下游的擴(kuò)增。 3．鹽藻雙交換葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化結(jié)果的初步鑒定在新增同源片段的基礎(chǔ)上，對已有的葉綠體轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行改造，構(gòu)建成鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體pMDko-bar以用于葉綠體轉(zhuǎn)化。用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型鹽藻細(xì)胞。 實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)果 1．鹽藻完整葉綠體的分離及高純度cpDNA的制備蔗糖密度梯度離心結(jié)果表明分離到了大量的葉綠體，相差顯微鏡及電鏡觀察證實(shí)了所得葉綠體的完整性。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測cpDNA，并用紫外分光光度儀檢測cpDNA的濃度和純度，結(jié)果顯示，抽提到的cpDNA濃度約2.201μg/ml，A260/A280接近1.8，說明其含量及純度都達(dá)到了比較理想的狀態(tài)。 2．鹽藻chiN基因未知側(cè)翼區(qū)的擴(kuò)增2．1chiN基因未知上游側(cè)翼的

11、擴(kuò)增經(jīng)過兩輪的擴(kuò)增得到一條3000 bp的片段，測序結(jié)果顯示其3’端與以前實(shí)驗(yàn)中用簡并引物擴(kuò)增得到的1269 bp的chiN的5’端完全吻合。 2．1chiN基因未知下游側(cè)翼的擴(kuò)增兩輪的擴(kuò)增得到一條650 bp的片段，測序結(jié)果顯示其5’端與已知的1269 bp的chiN的3’端完全吻合。 3．鹽藻雙交換葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化的初步鑒定酶切鑒定雙交換葉綠體轉(zhuǎn)化載體pMDko-bar插入片段大小、方向均正確。轉(zhuǎn)過的藻株在

12、篩選壓力下，于一周后肉眼觀察到轉(zhuǎn)化藻株與陰性對照藻株(未加質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化后加入．PPT)生長狀態(tài)存在明顯差異。而與陽性對照(未加質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化后不加PPT)的生長狀態(tài)并無很大差別。則可以推知已將目的基因成功轉(zhuǎn)入鹽藻葉綠體。結(jié)論1．在分離到了大量完整的鹽藻葉綠體基礎(chǔ)上，通過對傳統(tǒng)方案的優(yōu)化得到足量的高純度cpDNA。 2．從構(gòu)建的鹽藻葉綠體基因組步行文庫中成功擴(kuò)增得到用于葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的同源片段，并構(gòu)建了葉綠體轉(zhuǎn)化載體。