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文檔簡介
1、逆境脅迫嚴重影響到植物的生長,提高植物抗逆性的研究因而有著極為重要的現(xiàn)實意義.紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是當今世界上種植面積最大,應用最廣泛的多年生豆科牧草.借助植物基因工程手段提高苜蓿抗逆性是現(xiàn)代育種的重要途徑.本文利用農(nóng)桿菌介導法,將從鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)中克隆到的抗逆基因Dscbr(編碼一種早期光誘導蛋白)轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中,提高其抗逆性.首先以再生能力強的"中苜一號"苜蓿品種作為受體
2、材料,以葉片作為外植體接種于UM+2,4-D(2.0mg/L)+KT(0.25mg/L)培養(yǎng)基上,經(jīng)愈傷組織誘導、胚狀體分化、生芽和生根培養(yǎng),形成了完整的再生植株,建立了適合于遺傳轉(zhuǎn)化操作的苜蓿再生系統(tǒng).為了提高轉(zhuǎn)化效率,利用植物表達載體pCAMBIA2301G中的GUS基因進行轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,經(jīng)GUS組織化學染色、抗性愈傷組織分析其轉(zhuǎn)化條件為:葉片預培養(yǎng)4-5d,用農(nóng)桿菌菌液(OD<,600>=0.3~0.8)侵染20min,然后在培
3、養(yǎng)基上鋪一層滅菌濾紙共培養(yǎng)7d后清洗.在此基礎(chǔ)上將Dscbr基因構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA2301G中,采用凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中.在Km 15mg/L選擇壓下,采用前期和后期篩選的方法,經(jīng)過120d后獲得了52株轉(zhuǎn)化過的再生苗.最后對再生苗進行分子生物學檢測,用快速小量法提取莒蓿總DNA,PCR檢測出4棵陽性苗,轉(zhuǎn)化率為7.7﹪.經(jīng)RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)有1棵轉(zhuǎn)
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