蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建及蓖麻毒蛋白基因干擾載體轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、蓖麻作為“綠色石油”,被廣泛應(yīng)用于化工,航空航天等多個領(lǐng)域,其開發(fā)具有廣泛的前景。但由于蓖麻籽中含有多種劇毒物質(zhì),如蓖麻毒蛋白、凝集素等,極大的限制了蓖麻的綜合利用。利用RNAi技術(shù),沉默蓖麻毒蛋白基因,改良蓖麻品質(zhì),培育低毒的蓖麻品種,為蓖麻分子育種提供新的種質(zhì)資源,對拓寬蓖麻的綜合利用有重要意義。
　　 本試驗建立了蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化體系,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,利用蓖麻毒蛋白A鏈基因所構(gòu)建的基因沉默雙元表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化通蓖5號蓖麻品種,

2、獲得了抗性植株。對所獲得的植株,分別從DNA、RNA水平上進(jìn)行檢測,初步判斷成功構(gòu)建了蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化后獲得蓖麻毒蛋白A鏈基因被抑制的植株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1在建立蓖麻高效再生體系的研究中,采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蓖麻子葉節(jié),成功地將RTA-RNAi基因?qū)氡吐?。試驗中通過蓖麻子葉節(jié)再生試驗,研究了蓖麻子葉節(jié)抗性篩選、根癌農(nóng)桿菌的侵染濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間、生根培養(yǎng)等因素對蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。試驗結(jié)果表明,外植

3、體預(yù)培養(yǎng)2d,農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.5為宜。侵染時間為10min最佳。侵染后培養(yǎng),轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素抗性篩選的培養(yǎng)基誘導(dǎo)篩選培養(yǎng),經(jīng)過四周的抗性篩選后,獲得轉(zhuǎn)基因抗性植株,將獲得的抗性植株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基,誘導(dǎo)生根。經(jīng)過二十天的生根培養(yǎng)。將帶有3～5cm的不定根的抗性苗,煉苗移栽,3個月后得到再生植株。
　　 2采用CTAB法提取蓖麻基因組DNA,進(jìn)行目的基因片段PCR擴(kuò)增,得到290bp目的基因片段,與預(yù)期效果一致,將P