蓖麻毒蛋白誘導HuTu-80細胞凋亡的比較蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、蓖麻毒素是蓖麻籽中存在的一種能使核糖體失活的高效蛋白質(zhì)，并由A、B鏈構成，A鏈是具有N-糖苷酶活性的活性鏈，導致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，引發(fā)細胞死亡;B鏈具有凝集素活性，能夠識別和結合細胞表面含有半乳糖結構的受體，協(xié)助A鏈進入細胞。當一個蓖麻毒素分子進入到細胞內(nèi)時，就可以使整個細胞的蛋白質(zhì)合成停止最終導致細胞死亡。本研究通過比較蛋白質(zhì)組學的研究手段，用蓖麻毒蛋白誘導人十二指腸腺癌細胞(HuTu-80)，分析全蛋白差異表達的情況，為蓖麻毒蛋

2、白在HuTu-80細胞中的作用機理提供新的試驗窗口。
　　 1.本研究首先采用硫酸銨鹽析法，從蓖麻種籽中提粗素，通過Sepharose4B柱親和層析和SephacrylS-200柱凝膠過濾層析對其進行純化，經(jīng)β-巰基乙醇處理，可見A鏈分子量為28KDa，B鏈的分子量為32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鑒定純化后的蓖麻毒素達到了電泳純。測定其濃度后，用獲得的蓖麻毒蛋白對HuTu-80細胞進行IC50試驗。結果表明:細胞形態(tài)發(fā)生

3、變化，而IC50為200ng/ml。
　　 2.構建蓖麻毒蛋白誘導HuTu-80細胞的凋亡模型，通過MTT排除試驗、AO/EB染色、AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡，確定蓖麻毒蛋白誘導HuTu-80細胞早期凋亡時相，提取細胞組分蛋白進行Western-blot分析，觀察HuTu-80細胞在凋亡過程中細胞色素c的遷移情況。結果表明:蓖麻毒蛋白對HuTu-80細胞的增殖和生長有明顯的抑制作用，IC50為200ng/m

4、l，最佳攻毒時間為8h，同時HuTu-80細胞的形態(tài)特征與生物化學特征也發(fā)生了一系列的變化，細胞核出現(xiàn)皺縮和破裂的情況，釋放出致密顆粒狀凋亡小體，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸出現(xiàn)外翻，而細胞色素c隨著蓖麻毒蛋白處理時間的增加，從線粒體易位到細胞漿逐漸顯著。
　　 3.用蓖麻毒蛋白濃度為200ng/ml，時間為8h處理細胞，分別提取正常組和處理組的HuTu-80細胞全蛋白，iTRAQ同位素標記技術與質(zhì)譜檢測技術得到1660個蛋白信息，其