紫杉醇誘導人膽管癌QBC939細胞凋亡的蛋白質組學研究.pdf

1、膽管癌臨床上起病隱匿，出現(xiàn)癥狀較晚，早期診斷困難，手術切除率較低，加之缺乏有效和敏感的化療藥物，預后較差。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細胞增殖失控和細胞分化異常的結果，同時也與腫瘤細胞凋亡失衡有關，針對腫瘤細胞凋亡失衡對腫瘤細胞凋亡進行干預性調節(jié)就不失為一種腫瘤治療策略。紫杉醇以其獨特的藥理作用成為熱點抗癌新藥，得到廣泛應用。但紫杉醇誘導細胞凋亡的確切作用機制還有待進一步研究。 隨著雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和質譜技術的進步，使蛋白質組分析

2、及其在臨床疾病中的應用成為重要的研究方法。本研究從細胞凋亡為切入點，采用體外細胞培養(yǎng)、體外藥物誘導膽管癌細胞凋亡、觀察細胞形態(tài)學、細胞流式儀分析細胞周期、蛋白質組學技術分析蛋白表達譜的差異技術路線，研究化療藥物紫杉醇對膽管癌細胞凋亡相關機制，旨在為研究膽管癌的發(fā)病機制、闡明抗癌藥物對膽管癌新的作用靶點，為指導臨床用藥提供基礎理論平臺。 第一章紫杉醇對膽管癌細胞株QBC939作用敏感性的體外測定 目的：探討紫杉醇對膽管癌細

3、胞作用的敏感性，為膽管癌的臨床治療尋找新的治療藥物。方法：體外培養(yǎng)膽管癌細胞QBC939，采用不同濃度紫杉醇予以干預，通過細胞形態(tài)觀察和MTT實驗，初步研究人紫杉醇對人膽管癌細胞QBC939的敏感性。結果：各濃度紫杉醇對抑制人膽管癌細胞QBC939生長均有明顯的抑制，具有時間一濃度依賴性。各濃度紫杉醇對QBC939N胞藥物干預組和未干預組(陰性對照組)的抑制作用差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。MTT法測得結果發(fā)現(xiàn)，紫杉醇對QBC93

4、9最大抑制率為67.02％，中效濃度為0.46μmol/L。結論：紫杉醇能抑制人膽管癌細胞QBC939的增殖，且抑制作用呈劑量和時間依賴效應。 第二章紫杉醇誘導的膽管癌細胞凋亡及細胞動力學檢測 目的：研究紫杉醇對膽管癌細胞周期及細胞凋亡率的影響，探討紫杉醇誘導膽管癌細胞發(fā)生調亡的機制。方法：應用流式細胞儀(FCM)檢測紫杉醇誘導膽管癌細胞凋亡，同時對細胞周期的變化和動力學予以檢測。結果：流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)實驗組：G0/G

5、1期占11.27％、S期51.17％、G2／M期33.82％、Sub-G1(apoptosis)3.74％。G0／G1期明顯減少，并出現(xiàn)亞二倍體峰，對照組：G0／G1期62.28％、S期17.49％、G2／M期8.16％、Sub-G1(apoptosis)12.07％，未見出現(xiàn)亞二倍體峰。結論：紫杉醇能誘導人膽管癌QBC9392胞發(fā)生凋亡，細胞被明顯阻滯在S期及G2／M期，且抑制作用呈劑量和時間依賴效應。 第三章2-DE技術分離

6、膽管癌細胞凋亡的差異表達蛋白 目的：篩選紫杉醇誘導膽管癌細胞凋亡的相關蛋白，尋找抗膽管癌藥物作用的新靶點。方法：應用比較蛋白質組學這一技術中的雙向凝膠電泳技術、計算機輔助圖像分析方法對紫杉醇誘導凋亡的膽管癌QBC939細胞進行蛋白分離和蛋白表達譜差異分析，篩選并鑒定誘導QBC939細胞凋亡的相關蛋白。結果：本研究通過雙向凝膠電泳分離測得干預組蛋白表達平均每張蛋白斑點數(shù)為(1081±29)個，對照組平均蛋白斑點數(shù)為(1179±36

7、)個。蛋白質點位置在等電聚焦(IEF)方向上其平均偏差為(2.46±0.24)mm，SDS-PAGE電泳垂直方向上的平均位置偏差為(2.65±0.22)mm，表明蛋白質點在雙向電泳具有較好的重復性。對照組和實驗組蛋白點匹配率分別為(90.1±0.14)％和(87.1±0.22)％(p<0.05)。匹配后在紫杉醇干預組中共發(fā)現(xiàn)68個差異表達蛋白點，其中47個表達下調和21個上調。結論：應用蛋白質組學技術分析所獲得的68個差異蛋白質點可能在

8、QBC939細胞發(fā)生凋亡過程中發(fā)揮重要作用。 第四章差異表達蛋白的質譜鑒定和生物信息學分析 目的：鑒定差異表達的蛋白點，篩選膽管癌新的腫瘤標志物，為膽管癌的早期診斷、療效觀察提供基礎理論依據(jù)。方法：MALDI-TO-F-MS質譜測定其膠內酶解后的肽指紋圖譜(PMF)。結果：MALDI-TOF-MS，獲得28張PMF，在限制相應的查詢條件下應用Mascot軟件搜索SWISS-PROT／TREMBL數(shù)據(jù)庫，初步質譜鑒定鑒定發(fā)

9、現(xiàn)11個與凋亡相關的差異表達蛋白，其中Gankyrin、CDC27Hs、LaminBl、p16INK4A、p21、Noxa蛋白表達上調，Glyceraldehyde 3-phosphate dehyrogenase、Peroxredoxin2、NucleolarphosphoproteinB 23、Antioxidant protein 2蛋白表達下調。結論：被鑒定出的11個與細胞凋亡相關的差異蛋白點提示紫杉醇是通過多個重要蛋白，發(fā)揮其