外源性IL-6對膽管癌細胞QBC939的生物學作用及其分子機制的研究.pdf

1、第一部分外源性IL-6對QBC939細胞凋亡及Bcl-2 mRNA表達的影響
　　 背景:膽管癌是一種來源于膽管上皮的，具有去分化及侵略性特征的惡性腫瘤，它的發(fā)病經(jīng)過一個從正常膽管上皮細胞轉變?yōu)檠装Y膽管上皮細胞，然后去分化自主增生成為癌前病變最后癌變的過程，炎癥因子在這個過程中發(fā)生了重要的作用。IL-6被認為是與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關的炎癥因子，IL-6能夠刺激炎性膽管上皮細胞和膽管癌細胞增殖，并且在其他細胞如CD34+造血干

2、細胞、肝臟星狀細胞、腎癌細胞株等的實驗研究中發(fā)現(xiàn)IL-6能夠通過調節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bax、Bcl-xL等的表達從而達到抗凋亡的作用。bcl-2是一種有抑制凋亡作用的癌基因，在多種腫瘤中已經(jīng)證實了bcl-2與腫瘤細胞逃避凋亡相關。將正常膽管細胞長期與感染性膽汁接觸可增加Bcl-2的表達，這提示細胞因子持續(xù)刺激與Bcl-2表達的改變之間可能存在聯(lián)系。
　　 目的:
　　 觀察外源性IL-6對膽管癌細胞系

3、QBC939凋亡以及Bcl-2 mRNA的影響。
　　 方法:
　　 1、用MTT法觀察外源性IL-6對膽管癌細胞QBC939增殖的作用；
　　 2、通過Annexin V/FITC和PI染色流式細胞分析檢測外源性IL-6對QBC939細胞凋亡的影響。
　　 3、用RT-PCR檢測外源性IL-6對Bcl-2 mRNA表達的影響。
　　 結果:
　　 1、外源性IL-6處理后，QBC939增

4、殖較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在一定劑量范圍內，外源性IL-6促進QBC939增殖的效應有濃度依賴性，且劑量效應呈對數(shù)關系(P<0.05)；
　　 2、外源性IL-6處理后QBC939凋亡率比對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；
　　 3、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL外源性IL-6培養(yǎng)QBC939細胞24小時后，RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA含量逐漸增加，統(tǒng)計學差異有

5、顯著性(P<0.01)并且與濃度正相關(r=1)。
　　 結論:
　　 1、在體外試驗中，外源性IL-6在一定劑量范圍內呈濃度依賴方式促進QBC939細胞生長，并抑制QBC939細胞凋亡；
　　 2、外源性IL-6抑制QBC939細胞凋亡可能與上調Bcl-2基因表達相關。
　　 第二部分外源性IL-6調控膽管癌細胞QBC939 Bcl-2基因表達的分子機制研究
　　 背景:目前已知IL-6可以通過

6、與廣泛分布于膽管癌細胞膜表面的IL-6受體(IL-6 receptor，IL-6R)相結合形成IL-6/IL-6R復合物，激活如下兩條信號通路：JAK/STAT和Ras/MAPK。IL-6/IL-6R復合物可直接激活JAK蛋白酪氨酸激酶，然后進入JAK/STAT通路激活信號分子STAT和Tec。這些信號傳導途徑調節(jié)凋亡相關基因的表達，從而發(fā)揮IL-6的促細胞生長、分化和抗凋亡作用。另一方面，IL-6/IL-6R復合物可誘導Src同源膠原

7、蛋白與生長因子受體結合蛋白-2(SHP2)復合物形成和活化，然后與鳥嘌呤核苷酸交換因子結合，激活Ras蛋白。活化的Ras轉導信號參與絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)途徑。正常膽管細胞長期與感染性膽汁接觸可增加Bcl-2的表達，且膽管癌Bcl-2的表達增加，這提示細胞因子持續(xù)刺激與Bcl-2的表達改變之間存在可能的聯(lián)系。2000年，Michel等用IL-6、干擾素-a、胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowth facto

8、r1)處理骨髓瘤細胞，結果發(fā)現(xiàn)IL-6能上調Mcl-1表達，2007年有研究者在另外一項CD34+造血干細胞的實驗中研究發(fā)現(xiàn)IL-6可以通過JAK/STAT通路上調Bcl-2表達。
　　 目的:
　　 分別阻滯JAK/STAT和Ras/MAPK途徑，探討外源性IL-6調控膽管癌細胞系QBC939Bcl-2 mRNA表達的分子機制。
　　 方法:
　　 1、采用IL-6刺激人膽管癌細胞QBC939使Bcl-

9、2mRNA表達上調，再分別用JAK/STAT拮抗劑AG490及MEK/ERK拮抗劑UO126處理；
　　 2、MTT法檢測細胞的增殖狀態(tài)，Annexin V/FITC和PI染色流式細胞儀分析凋亡情況；
　　 3、RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA水平；
　　 4、Western印跡法檢測p-STAT3和P-ERK1的表達水平。
　　 結果:
　　 1、UO126和AG490處理后，QBC939細

10、胞增殖程度較IL-6組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　 2、UO126和AG490處理后，QBC939細胞凋亡率分別提高為18.8±4.13％和20.3±3.88％，與IL-6組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組間無明顯差異(P>0.05)；
　　 3、AG490處理后，Bcl-2 mRNA含量比IL-6組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 4、對照組QBC939細胞有P-

11、STAT3和p-ERK表達；IL-6作用于QBC939細胞株后，p-STAT3和p-ERK1含量均較對照組明顯升高；AG490作用后，p-STAT3含量明顯下降；UO126作用后，p-ERK1含量明顯下降。
　　 結論:
　　 1、IL-6可同時激活JAK/STAT和Ras/MAPK遴徑；
　　 2、主要通過JAK/STAT途徑調節(jié)QBC939細胞Bcl-2 mRNA表達。
　　 第三部分外源性IL-6對

12、QBC939裸鼠移植瘤生長的影響
　　 背景:BALB/C裸小鼠是一種近交系小鼠，后代基因純合程度高，個體間差異小，此種小鼠先天無毛無胸腺，T淋巴功能完全缺乏，對異種移植不發(fā)生排斥反應，因此特別適用于建立移植瘤模型。移植后的人體腫瘤在裸小鼠體內仍保持有原有組織形態(tài)、免疫學特點及特有的染色體組型。目前建立裸鼠移植瘤模型是一種較為理想的研究腫瘤在體內的生物學特性及調控機制的模型系統(tǒng)。
　　 目的:
　　 建立QBC9

13、39裸鼠移植瘤模型，觀察外源性IL-6在體內對膽管癌細胞系QBC939生長的影響。
　　 方法:
　　 1、采用皮下注射法建立裸鼠移植瘤模型；
　　 2、分別使用IL-6及AG490進行腹腔注射給藥，觀察移植瘤生長情況。
　　 結果:
　　 1、本實驗成功建立裸鼠體內膽管癌皮下移植瘤模型；
　　 2、移植瘤在無藥物干預時有自主生長，IL-6干預后移植瘤生長明顯增快，差異有統(tǒng)計學意義(P<0