肝硬化模型比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及扶正化瘀方對(duì)血漿蛋白質(zhì)組影響.pdf

1、第一部分: 肝硬化模型肝組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 研究背景與目的：肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，是我國(guó)疾病防治的主要任務(wù)之一。肝纖維化是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過(guò)程。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用各種技術(shù)手段從整體角度分析蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。 疾病蛋白質(zhì)組學(xué)為探討疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、早期診斷和治療提供重要理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型

2、，建立肝組織蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)平臺(tái)；掌握進(jìn)行大鼠肝組織雙向凝膠電泳所需要的各種條件；了解CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型肝組織蛋白質(zhì)組變化，為進(jìn)一步研究肝纖維化、肝硬化發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：將雄性S-D大鼠隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組(n=6)給予橄欖油腹腔注射；肝硬化模型組(n=10)用CCl<,4>(CCl<,4>／橄欖油：v／v=1／1)按1ml／kg腹腔注射，每周2次，共8周誘導(dǎo)肝硬化模型。病理組織學(xué)觀察肝纖維化嚴(yán)重程度

3、并評(píng)分，用Masson三色染色法進(jìn)行膠原染色。計(jì)數(shù)肝竇內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)觀察肝星狀細(xì)胞的活化情況。對(duì)肝組織進(jìn)行雙向凝膠電泳，應(yīng)用PDQUST圖像分析軟件將肝硬化模型組與對(duì)照組肝組織2-DE膠圖進(jìn)行匹配，不同膠匹配點(diǎn)相對(duì)含量差異2倍及其以上的點(diǎn)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)消化、MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜儀鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索確定差異蛋白質(zhì)。用免疫印跡法驗(yàn)證雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)表達(dá)改變。 結(jié)果：肝硬化

4、模型組肝組織病理均提示典型纖維間隔和假小葉形成，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加。肝組織雙向電泳凝膠重復(fù)性滿意，顯示的蛋白斑點(diǎn)在分布、背景等方面基本一致。通過(guò)PDQtJST軟件分析的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)消化、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索有33個(gè)點(diǎn)得到鑒定，分別屬于28種蛋白質(zhì)。在這些差異蛋白質(zhì)中，有5種蛋白質(zhì)僅在肝硬化模型組中出現(xiàn)；2種蛋白質(zhì)僅在正常組出現(xiàn)；12種蛋白質(zhì)在肝硬化模型組上調(diào)，9種蛋白質(zhì)下調(diào)。這些蛋白質(zhì)按其功能特性可分為與細(xì)胞增殖

5、、能量代謝相關(guān)酶類、物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和熱休克相關(guān)蛋白質(zhì)。免疫印跡法進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組技術(shù)顯示的alpha crystallin B chain變化趨勢(shì)。 結(jié)論：成功構(gòu)建肝硬化大鼠動(dòng)物模型。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從整體角度將蛋白質(zhì)變化綜合一起，得到CCl<,4>誘導(dǎo)肝硬化大鼠肝組織蛋白質(zhì)組的特征性變化。在CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝硬化形成過(guò)程中，肝組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能通過(guò)影

6、響細(xì)胞增殖、能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、細(xì)胞骨架形成和運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激反應(yīng)等參與、反映肝硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 第二部分:肝硬化模型血漿比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究研究 背景與目的：許多疾病可導(dǎo)致血漿中多種蛋白質(zhì)改變，這種特征性變化對(duì)疾病診斷和療效監(jiān)測(cè)具有重要意義。迄今為止人類僅對(duì)少數(shù)血漿蛋白作為臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)用于某些疾病的診斷。血漿蛋白質(zhì)組的發(fā)展拓寬了對(duì)血漿蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)。全面而系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)肝纖維化和肝硬化時(shí)血漿蛋白改變情況，將有助于肝纖維化、肝

7、硬化的發(fā)病機(jī)制、診斷和藥效研究。本實(shí)驗(yàn)將初步建立血漿蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺(tái)；掌握去除大鼠血漿白蛋白和球蛋白的方法以及進(jìn)行血漿雙向凝膠電泳所需要的各種條件；了解CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝硬化疾病模型的血漿蛋白質(zhì)組變化，為進(jìn)一步研究肝硬化的發(fā)病機(jī)制和診斷奠定基礎(chǔ)。方法：用CCl<,4>制備肝硬化動(dòng)物模型，單純橄欖油腹腔注射組作為對(duì)照組。造模8周后抽取血液，同組間血漿混勻，去除血漿中白蛋白和球蛋白。進(jìn)行雙向凝膠電泳，應(yīng)用PDQUST圖像分析軟件對(duì)各種

8、條件下除血漿白蛋白和球蛋白的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。將肝硬化模型組與對(duì)照組血漿2-DE膠圖進(jìn)行匹配，不同膠匹配點(diǎn)相對(duì)含量的差異2倍及其以上的點(diǎn)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)消化、MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜儀鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定差異蛋白質(zhì)。用免疫印跡法驗(yàn)證雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)所鑒定的蛋白質(zhì)表達(dá)改變。 結(jié)果：使用Albumin/IgG Removal Kit可去除血漿中大部分白蛋白和球蛋白。去除后，雙向凝膠電泳顯示的蛋白質(zhì)斑

9、點(diǎn)由處理前的260±15個(gè)增加到598±42個(gè)。膠重復(fù)性滿意，顯示蛋白斑點(diǎn)在分布、背景等方面基本一致。通過(guò)PDQUST軟件分析的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)消化、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索有20個(gè)點(diǎn)得到鑒定，分別屬于16種蛋白質(zhì)：血漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶前體、載脂蛋白A-IV前體、載脂蛋白E、結(jié)合珠蛋白、前白蛋白、血漿視黃醇結(jié)合蛋白、α1-抗胰蛋白酶、微管相關(guān)調(diào)節(jié)激酶1、α1-巨球蛋白、補(bǔ)體4、α抑制劑H4重鏈、轉(zhuǎn)鐵蛋白、肝臟再

10、生相關(guān)蛋白、波形纖維蛋白和RIKEN eDNAl700025816。免疫印跡法進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組研究顯示的結(jié)合珠蛋白變化趨勢(shì)。 結(jié)論：去除大鼠血漿中的白蛋白和球蛋白可明顯增加雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)的顯示，優(yōu)化了血漿2-DE圖譜。本研究建立的血漿蛋白質(zhì)組研究平臺(tái)可用于疾病機(jī)制的研究。CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型血漿中細(xì)胞防御和免疫相關(guān)蛋白質(zhì)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架和轉(zhuǎn)化調(diào)控蛋白、急性時(shí)相反應(yīng)蛋白等在表達(dá)量上不同程度地發(fā)生了

11、變化，提示這些蛋白質(zhì)表達(dá)改變可能與肝硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，反映了肝硬化時(shí)血漿蛋白質(zhì)的整體改變。 第三部分:扶正化瘀方干預(yù)肝硬化大鼠血漿比較蛋白質(zhì)組研究研究 背景與目的：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析中藥復(fù)方對(duì)CCl<,4>誘導(dǎo)肝纖維化、肝硬化大鼠血漿與正常血漿蛋白質(zhì)組差異表達(dá)，以期篩選出與藥物作用相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，為肝纖維化、肝硬化的藥物治療機(jī)制和療效評(píng)價(jià)提供依據(jù)。目前扶正化瘀方在治療肝炎后肝硬化及慢性乙型肝炎肝纖維化方面取得良

12、好的臨床效果，其抗肝纖維化作用機(jī)制是多方面的，具有復(fù)方中藥的多成分、多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，蛋白質(zhì)組學(xué)為從整體水平研究扶正化瘀方開辟了新途徑。以CCl<,4>大鼠肝纖維化模型作為研究對(duì)象，探討肝纖維化過(guò)程中血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)改變，揭示扶正化瘀方對(duì)肝纖維化多途徑作用機(jī)制及其療效評(píng)價(jià)。 方法：將雄性S-D大鼠隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組(n=6)給予橄欖油腹腔注射；肝硬化模型組(n=10)給予CCl<,4>(CCl<,4>/橄欖油

13、：v/v=1/1)按1ml/kg腹腔注射，每周2次，共8周誘導(dǎo)肝硬化模型；扶正化瘀方組(n=10)在CCl<,4>腹腔注射同時(shí)給予扶正化瘀方灌胃。8周后通過(guò)Masson三色染色法用圖像分析儀自動(dòng)分析肝臟膠原面積。應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)經(jīng)銀染顯色和PDQUST7.3軟件分析凝膠圖像，對(duì)三組中表達(dá)均有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串連質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：扶正化瘀方干預(yù)組較模型組肝纖維化程度明顯減輕，膠原纖維在肝內(nèi)沉積減

14、少(8.9％±3.7％vs．12.4％±4.7％，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)去除血漿中的高豐度蛋白質(zhì)可獲得重復(fù)性較好的血漿蛋白質(zhì)圖譜。共鑒定出10個(gè)明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)中，血漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及其前體、前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白A-IV前體、補(bǔ)體4、α抑制劑H4重鏈和微管相關(guān)調(diào)節(jié)激酶1在肝硬化大鼠血漿中表達(dá)減少，扶正化瘀方干預(yù)組表達(dá)增加，肝臟再生相關(guān)蛋白和波形纖維蛋白在肝硬化大鼠血漿中表達(dá)增加，扶正化瘀方干預(yù)組表達(dá)減少。