基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學方法對食品蛋白質(zhì)糖基化的研究.pdf

1、本論文主要采用基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學方法，包括傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)、多級質(zhì)譜以及氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)(HDX-MS)研究了食品蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外在加工條件對蛋白質(zhì)糖基化的影響機制，并對糖基化蛋白質(zhì)的構(gòu)象進行解析;采用一整套蛋白質(zhì)組學的方法，包括全體蛋白質(zhì)的提取分離、蛋白質(zhì)的鑒定，應用SDS-PAGE技術(shù)、膠內(nèi)酶解技術(shù)以及超高效液相色譜-多維質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蛋清中的蛋白質(zhì)組分進行鑒定，并對其中各組分的糖基化程度

2、和位點進行鑒定，結(jié)果表明:
　　 (1)卵清蛋白的二硫鍵被還原后其結(jié)構(gòu)被破壞導致其糖基化程度提高，在干熱狀態(tài)下，其糖基化肽段從6增加到11個，在溶液狀態(tài)下從1增加到2個;且高反應物濃度和能量傳遞效率導致干熱反應糖基化程度遠遠高于濕熱反應;通過鑒定糖基化位點發(fā)現(xiàn)卵清蛋白的糖基化位點主要是賴氨酸殘基;通過結(jié)合卵清蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其糖基化位點受多種因素的影響，包括蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、氫鍵以及相鄰氨基酸的組成;卵清蛋白經(jīng)還原后再糖基化

3、提高了蛋白質(zhì)的乳化性和泡沫性質(zhì)。
　　 (2)卵清蛋白與食品加工過程中常見的四種還原糖在高溫溶液中反應，通過測定反應產(chǎn)物的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，卵清蛋白-葡萄糖和卵清蛋白-麥芽糖體系的褐變程度、還原力和DPPH清除力最大;而卵清蛋白-葡萄糖和卵清蛋白-乳糖體系具有較高的TEAC值，是制備抗氧化劑的一種有效方式;卵清蛋白-糖在溶液中反應后其產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)與其褐變程度具有一定的相關(guān)性，顏色越深，抗氧化活性越高;不同的糖基化產(chǎn)物的熱力學性質(zhì)不同

4、，糖基化可以改變卵清蛋白的熱穩(wěn)定性。
　　 (3)將卵清蛋白與葡萄糖在一定的條件下反應后使其部分糖基化，通過胃蛋白酶酶解后采用高分辨率質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)的糖基化程度及其位點，再采用氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)研究糖基化后蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。結(jié)果表明，糖基化后的卵清蛋白經(jīng)氫氘交換后大部分肽段被保護，表明糖基化后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定;卵清蛋白糖基化和非糖基化的區(qū)域構(gòu)象均發(fā)生變化，表明糖基化不僅可以影響其糖基化位點局部的構(gòu)象變化，而且可影

5、響其遠處的構(gòu)象。
　　 (4) DHPM預處理可以促進蛋白質(zhì)的糖基化反應，提高BSA的糖基化程度并增加糖基化位點;100 MPa下的DHPM預處理對BSA的糖基化影響最大，糖基化位點由7個增加至11個，大部分肽段的DSP值在100 MPa時最大;糖基化反應結(jié)合高分辨率的質(zhì)譜分析可以用來探測壓力誘導的蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化;DHPM誘導的蛋白質(zhì)去折疊以及糖基化反應的加快表明DHPM為食品加工過程中糖基化反應的控制提供了一種有效方法。

6、r>　　 (5)采用氫氘交換質(zhì)譜的方法研究不同條件DHPM對BSA構(gòu)象的影響，結(jié)果表明BSA經(jīng)DHPM處理后BSA結(jié)構(gòu)被破壞，總體結(jié)構(gòu)變松散，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ趨于去折疊狀態(tài)，結(jié)構(gòu)域Ⅰ被保護，趨于穩(wěn)定;不同壓力處理導致其去折疊程度不同，在100MPa時，去折疊程度最大;肽段的去折疊程度與糖基化程度相關(guān)，與上章中糖基化程度和糖基化位點結(jié)論基本一致。
　　 (6)蛋清蛋白中含有47種不同的蛋白質(zhì)，分子量分布很廣，從4248到275408