基于生物質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)新方法研究.pdf

1、本論文研究?jī)?nèi)容涉及化學(xué)學(xué)科的分析化學(xué)、化學(xué)生物學(xué),是屬于交叉學(xué)科的研究。研究主要通過對(duì)糖基化相關(guān)分離富集技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)等技術(shù)方法的運(yùn)用和創(chuàng)新,以準(zhǔn)確、高效的揭示重要樣本的糖基化修飾,包括糖基化位點(diǎn)和糖鏈信息。
　　鑒于蛋白質(zhì)糖基化翻譯后修飾的重要性,糖蛋白質(zhì)組學(xué)成為后蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。近些年來,隨著與糖基化相關(guān)的分離富集技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)等的發(fā)展和進(jìn)步,越來越多具有重要意義的生物樣本中的糖基化修飾現(xiàn)象被揭示

2、和深入研究。盡管如此,現(xiàn)階段,在與糖基化研究相關(guān)的很多方面,方法學(xué)上的探索和發(fā)展還在不斷繼續(xù)。例如,分離富集技術(shù)還處于不斷優(yōu)化、完善,甚至發(fā)掘更優(yōu)途徑的階段;另外,生物質(zhì)譜技術(shù)也正被全方面挖掘可以傳達(dá)出來的信息,以用于糖基化的解析。日益增加的糖基化研究相關(guān)數(shù)據(jù)的產(chǎn)出,以及人工解析糖基化的難度,也催生了生物信息學(xué)手段被不斷開發(fā)、應(yīng)用到這一領(lǐng)域,以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的、高通量的數(shù)據(jù)解讀,為更深入的糖基化研究提供支持。盡管如此,由于糖基化修飾的復(fù)雜性,

3、使這一領(lǐng)域還有很多的機(jī)遇和挑戰(zhàn),仍然有很多亟待探索的重要的生物樣本,完整糖肽的分析仍處于起步階段等。本論文工作主要基于生物質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì),聯(lián)合并改善糖基化相關(guān)的分離富集技術(shù),致力于為糖蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域提供重要、獨(dú)特的數(shù)據(jù),以及建立具高效性和實(shí)用性的糖基化解析平臺(tái)。本論文工作的主要貢獻(xiàn)是:
　　(1)首次揭示了正常人肝的N-糖基化修飾譜,獲得了迄今最大的正常人肝N-糖基化蛋白/位點(diǎn)的數(shù)據(jù)集,是相關(guān)后續(xù)研究的重要參考和生物信息學(xué)解讀的數(shù)

4、據(jù)基礎(chǔ):研究共獲得了915個(gè)N-糖蛋白及其包含的1,786個(gè)糖基化位點(diǎn)信息:是正常人肝蛋白表達(dá)譜的有利補(bǔ)充,提供了382個(gè)新增蛋白;基于該數(shù)據(jù)集,通過生物信息學(xué)解讀獲得了豐富信息。
　　(2)建立了處于國際領(lǐng)先水平的、高通量的完整糖基化肽段解析平臺(tái)(GRIP):應(yīng)用精簡(jiǎn)的、基于實(shí)驗(yàn)的糖肽庫而非巨大的糖肽理論庫作為軟件檢索的基礎(chǔ),通過嚴(yán)格的質(zhì)量控制,在實(shí)際樣品鑒定中獲得出色的效果;目前己實(shí)現(xiàn)血清樣本中上千條N-糖肽的解析,并充分揭示

5、了糖基化的微觀不均一性,不但在高通量完整糖肽的研究領(lǐng)域處于前沿地位,而且有望成為血清糖基化檢測(cè)的有力工具。
　　(3)新穎的將串聯(lián)多酶切技術(shù)與糖基化富集技術(shù)聯(lián)合,建立了改善傳統(tǒng)糖基化實(shí)驗(yàn)路線不足的新策略:策略之一,可改善高特異性富集下僅依賴去糖基化肽段實(shí)現(xiàn)蛋白、位點(diǎn)的鑒定,而使糖蛋白序列覆蓋度較低的問題,以及增加糖基化位點(diǎn)鑒定的可靠度;策略之二,有別于傳統(tǒng)完整糖肽分析中糖蛋白/位點(diǎn)鑒定與糖肽解析分流程進(jìn)行的路線,可僅使用一個(gè)流程、

6、一步到位的實(shí)現(xiàn)蛋白鑒定和糖肽解析。
　　(4)首次將幾種基于B-消除反應(yīng)原理的O-糖基化研究方法比較、應(yīng)用于實(shí)際樣本血清:不但獲得了初具規(guī)模的O-糖基化數(shù)據(jù)集,而且方法間表現(xiàn)出的低互補(bǔ)性等重要特征,為相關(guān)方法學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展提共了有利的參考和指導(dǎo)。
　　論文一共分為以下四章進(jìn)行闡述:
　　第一章緒論:闡述糖基化蛋白的重要性,并介紹糖蛋白質(zhì)組研究相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀。
　　作為最主要和普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,糖基化

7、的作用涉及生理、病理等眾多方面。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結(jié)構(gòu)的改變,都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。不但目前已知的很多疾病的診斷標(biāo)志物是糖蛋白,而且通過國際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的藥物中,糖蛋白也占到較高的比例。糖蛋白主要有四類(N-連接、O-連接、GPI錨定和C-連接),研究最多的是其中的N-連接糖基化和O-連接糖基化,這也是我們目前研究工作主要關(guān)注的類型。糖基化的研究雖然至今仍是個(gè)難題,但在各種技術(shù)發(fā)展的推動(dòng)下已有長(zhǎng)足進(jìn)步。例如,糖基化分離富集技術(shù)一定程度上改善

8、了高豐度非糖基化蛋白/肽段對(duì)糖基化目標(biāo)物的掩蓋和抑制;各種特異性或非特異性的蛋白水解酶、糖苷水解酶的運(yùn)用使對(duì)于糖基化位點(diǎn)、糖鏈的研究更為便利;生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使糖基化研究的規(guī)?；遮叧尚偷鹊?。即便如此,由于糖基化的復(fù)雜性,各種技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化仍是該領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。同時(shí),大量糖基化數(shù)據(jù),特別是大量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的產(chǎn)出,也催生了相關(guān)的生物信息學(xué)分析工具的發(fā)展。各種工具,不論是針對(duì)純糖鏈分析的,還是可用于糖肽分析的,盡管一定程度上解決了人工分析

9、遇到的問題,但是仍然有很大局限性,例如對(duì)樣本純度、規(guī)模等的要求都十分有限?？傮w來講,蛋白糖基化修飾的研究還處于發(fā)展階段,充滿機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
　　第二章：高通量N-糖基化位點(diǎn)研究:分為兩個(gè)章節(jié)(1)正常人肝蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)譜研究,以及(2)串聯(lián)雙酶解、高特異性N-糖基化富集鑒定新策略。
　　(1)作為人體最大的器官和主要的代謝器官,肝臟的功能及相關(guān)疾病的研究一直都備受關(guān)注。至2010年,中國人肝蛋白質(zhì)組計(jì)劃(CNHLPP)己

10、獲得了六千多個(gè)蛋白的表達(dá)信息。然而,由于生物樣本的復(fù)雜程度高、蛋白豐度分布廣,所以時(shí)至今日如何擴(kuò)大蛋白鑒定規(guī)模仍然是研究人員致力于解決的一個(gè)問題。將針對(duì)糖基化后修飾的分離富集作為一種降低樣本復(fù)雜程度的方式,不但可以針對(duì)性的獲得糖基化蛋白的相關(guān)信息,也有利于表達(dá)譜蛋白更全面的檢測(cè)。我們的工作聯(lián)合了不同分離富集技術(shù)(肼腙反應(yīng)法、親水相互作用法)和串級(jí)質(zhì)譜碎裂技術(shù)(碰撞誘導(dǎo)解離、電子轉(zhuǎn)移解離),獲得了大規(guī)模的正常人肝N-糖基化蛋白/位點(diǎn)數(shù)據(jù)集

11、:915個(gè)N-糖蛋白及其包含的l,786個(gè)糖基化位點(diǎn);382個(gè)蛋白是原正常人肝蛋白表達(dá)譜中未鑒定到的,其中更有120個(gè)蛋白為肝臟組織特異性表達(dá)的。通過大量生物信息學(xué)分析,該數(shù)據(jù)集提供/體現(xiàn)出糖基化在正常人肝中的重要規(guī)律和特征,是后續(xù)深入研究重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　(2)高通量的糖基化位點(diǎn)鑒定,特別是N-糖基化位點(diǎn)鑒定,也已在分離富集技術(shù)以及糖苷內(nèi)切酶(如PNGaseF)的幫助下成為常規(guī)流程。然而,由于高特異性的富集(例如迄今最為穩(wěn)定

12、表現(xiàn)出高特異性的肼腙化學(xué)反應(yīng)法),使獲得鑒定的糖蛋白序列覆蓋度偏低,有的甚至只有一條肽段覆蓋;另外,僅基于PNGaseF酶切產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)Asn分子量變化(+0.98Da)作為糖基化發(fā)生的證據(jù)也有不盡人意之處,例如該分子量變化較小、Asn可能發(fā)生自然水解等產(chǎn)生的假陽性。為了改善這些問題,我們統(tǒng)計(jì)并根據(jù)人類蛋白數(shù)據(jù)庫中的各種氨基酸分布頻率,以及蛋白酶的不同水解特異性,將兩種蛋白水解酶Lys-C和trypsin串聯(lián)使用,新穎的引入肼腙反應(yīng)

13、法對(duì)糖肽的富集和鑒定中。該策略在通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白的測(cè)試后,成功用于實(shí)際樣本細(xì)胞全蛋白裂解液。結(jié)果表明,在未犧牲富集方法高特異性的情況下,糖蛋白鑒定的序列覆蓋度平均增加了79.4％,約1/3的蛋白序列覆蓋度增加了一倍以上,有的增幅甚至高達(dá)350％。
　　第三章：高通量N-糖基化肽段研究:分為兩個(gè)章節(jié)(1)一步到位(one-pipeline)糖蛋白鑒定糖肽解析新策略,以及(2)高通量血清糖肽鑒定平臺(tái)(GRIP)的建立。
　　(1)糖

14、肽的解析,往往依賴于前期的分離富集。然而傳統(tǒng)方式上,在經(jīng)過肽段水平的富集后,糖蛋白的鑒定和糖肽分析需要分為兩個(gè)流程進(jìn)行:一個(gè)流程進(jìn)行去糖基化處理,以實(shí)現(xiàn)蛋白的質(zhì)譜鑒定(因?yàn)樘腔笮揎棤顟B(tài)目前無法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索鑒定);另一個(gè)流程保留糖鏈完整進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。我們認(rèn)為這些目的通過一個(gè)流程即可達(dá)到,而且能獲得附加信息。根據(jù)人類蛋白數(shù)據(jù)庫中的各種氨基酸分布頻率統(tǒng)計(jì),以及蛋白酶的不同水解特異性,我們將兩次酶解(Lys-C和trypsin酶解)與兩個(gè)

15、水平上的糖基化富集(蛋白水平和肽段水平)進(jìn)行了穿插聯(lián)合,使即使進(jìn)行了肽段水平上的富集,最終用于質(zhì)譜分析的混合物中既保留了完整糖肽,又包含了存在和數(shù)量都合理的非糖肽可用于蛋白鑒定,一舉兩得。該策略在通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白的測(cè)試后,成功用于經(jīng)一維凝膠電泳分離的血清樣本條帶中,結(jié)果通過55條非糖肽鑒定到23個(gè)糖基化蛋白,同時(shí)解析出25條的完整糖肽,其中包括2條O-糖肽(均為非冗余統(tǒng)計(jì))。該策略不但實(shí)現(xiàn)了目前來講數(shù)目可觀的復(fù)雜樣本的糖肽解析,而且末端唾液

16、酸化、核心巖藻糖化、bisecting乙酰葡糖胺化等重要的糖鏈特征結(jié)構(gòu)信息均被保留和揭示;糖基化微觀不均一性也被準(zhǔn)確揭示。
　　(2)高通量的完整糖肽解析是目前糖基化研究中亟待攻克的一個(gè)難題。由于糖基化的復(fù)雜性高、存在豐度低等問題,以及糖肽異于一般肽段的特殊的物化性質(zhì),使高通量質(zhì)譜分析或者獲得的數(shù)據(jù)復(fù)雜性大,或者無法通過單一的方式取得足夠信息;另外,目前仍沒有一種針對(duì)完整糖肽的富集方法,能高效的去除非糖肽的影響。這都對(duì)糖肽的解析造

17、成難度。目前瞄準(zhǔn)糖肽解析的應(yīng)用程序已有開發(fā),但是絕大多數(shù)或者對(duì)樣本復(fù)雜性的耐受度很低,或者給出使用者難以決斷的眾多結(jié)果,能被用戶方便、規(guī)?；褂玫钠脚_(tái)十分欠缺。GRIP是我們建立的糖肽解析平臺(tái)GlycopeptideRevealingandInterpretationPlatform的簡(jiǎn)稱,該平臺(tái)軟件的檢索基于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的、來自目標(biāo)樣本的肽段庫和糖鏈庫生成的糖肽庫,而非巨大的理論糖肽庫;這使得該糖肽庫不但適于具體樣本,可隨樣本而變,而且減

18、少了理論庫檢索的假陽性。另外,我們充分利用糖肽在質(zhì)譜中的碎裂特征,將這些特征作為譜圖篩選及假陽性控制的重要手段,準(zhǔn)確的從海量譜圖中篩選出糖肽譜圖并進(jìn)行解析。該研究目前己實(shí)現(xiàn)血清樣本中上千條非冗余糖肽的解析,結(jié)果中展示了蛋白糖基化微觀不均一性等重要信息,不但在國際上處于領(lǐng)先水平,也具有很好的實(shí)際應(yīng)用前景。
　　第四章：基于B-消除反應(yīng)的O-糖基化研究:比較和使用了現(xiàn)有的幾種beta-消除反應(yīng)在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果,為相關(guān)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)

19、用和發(fā)展研究提供了有利的參考和指導(dǎo)。
　　雖然分離富集方法以及廣譜性糖苷內(nèi)切酶的使用,使得N-糖基化位點(diǎn)的鑒定常規(guī)化,但對(duì)于O-糖基化的研究,由于其核心結(jié)構(gòu)眾多,且沒有廣譜性的糖苷水解酶,因而常規(guī)化、規(guī)?；腛-糖基化位點(diǎn)鑒定至今仍是個(gè)難題。多數(shù)以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)為目的的研究多采用基于B-消除/加成反應(yīng)的策略:消除反應(yīng)實(shí)現(xiàn)去糖基化,Ser/Thr側(cè)鏈形成不飽和鍵;加成反應(yīng)為原糖基化位點(diǎn)帶上利于后續(xù)分析、處理的質(zhì)量或富集標(biāo)簽。盡管有研究對(duì)

20、這類方法進(jìn)行了改善和使用,但范圍往往限于標(biāo)準(zhǔn)肽段等簡(jiǎn)單樣本。我們首次平行、比較使用了DTT加成法、氨水法、甲胺法等三種處理方法,不但考察了它們對(duì)同樣發(fā)生在Ser/Thr氨基酸上的磷酸化后修飾的影響,更將其應(yīng)用到實(shí)際血清樣本中,獲得了來自96個(gè)蛋白的157個(gè)O-糖基化位點(diǎn),但其中只有4個(gè)位點(diǎn)為一種以上方法共同鑒定。我們對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行分析還發(fā)現(xiàn)修飾發(fā)生在Ser氨基酸的比例高于Thr氨基酸(61％vs39％);同一蛋白中的糖基化位點(diǎn)常出現(xiàn)在鄰