金屬元素標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組多重定量新方法研究及應(yīng)用.pdf

1、發(fā)展蛋白質(zhì)組多重定量技術(shù)以精確測(cè)量多個(gè)不同生理或病理?xiàng)l件下的生物樣本蛋白質(zhì)組表達(dá)及翻譯后修飾的量的變化,從而發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物和具有重要生物學(xué)意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì),是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點(diǎn)。已發(fā)展的基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組多重定量方法,如iTRAQ標(biāo)記方法,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組的多重定量分析,但仍存在許多不足,如標(biāo)記試劑制備困難,價(jià)格昂貴,對(duì)質(zhì)譜分析儀器具有選擇性,定量的準(zhǔn)確性有待提高等。因此發(fā)展更加精確且價(jià)廉易得的蛋白質(zhì)組定量方法和

2、技術(shù)仍是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要目標(biāo)和極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。
　　金屬元素標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量方法是近年來(lái)發(fā)展的一種新方法,拓展了蛋白質(zhì)組定量的新思路。與穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法相比,金屬元素標(biāo)記方法具有很多自身的特點(diǎn):如制備金屬標(biāo)簽的試劑價(jià)廉易得;可供選擇的稀土金屬元素多,具有發(fā)展成多重金屬標(biāo)記技術(shù)的可能性;具有與生物質(zhì)譜技術(shù)和元素質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用,應(yīng)用于蛋白質(zhì)組相對(duì)和絕對(duì)定量的雙重優(yōu)勢(shì)等。
　　本文旨在建立價(jià)格相對(duì)低廉、定量穩(wěn)定可靠的

3、,應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的多重定量新方法?；诖?我們首次建立了標(biāo)記肽段N-端的金屬元素標(biāo)記結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組多重相對(duì)定量新方法及應(yīng)用研究。
　　首先,本研究選擇大環(huán)化合物四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)的四種鑭系金屬(Tb,Ho,Tm和Lu)螯合物作為金屬元素螯合標(biāo)簽(Metal Element Chelated Tag,MECT),并全面考察了影響金屬元素標(biāo)記反應(yīng)的各種影響因素。通過(guò)四氮雜環(huán)十二烷四乙酸琥珀酰亞胺活化酯(DO

4、TA-NHS-ester)與肽段胺基的共價(jià)鍵合反應(yīng),然后與四種鑭系金屬離子的螯合反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,標(biāo)準(zhǔn)合成肽段的金屬元素標(biāo)記效率高達(dá)99％,對(duì)騰沖嗜熱菌樣本的全蛋白胰酶酶解肽段也能實(shí)現(xiàn)高效率的標(biāo)記,表明金屬元素標(biāo)記具有溫和、穩(wěn)定、高效和無(wú)肽段歧視的優(yōu)點(diǎn)。
　　其次,本研究建立了金屬元素標(biāo)記與基質(zhì)輔助激光解吸附電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)結(jié)合的蛋白質(zhì)組多重相對(duì)定量新方法。以標(biāo)準(zhǔn)合成肽段和標(biāo)準(zhǔn)蛋白

5、質(zhì)為模型的研究結(jié)果表明:該方法在5倍的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)性(R2=0.99),較小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD≤13%)和合理的蛋白質(zhì)多重相對(duì)定量準(zhǔn)確性。而且,金屬元素標(biāo)記肽段在酸性介質(zhì)下具有良好的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)金屬元素標(biāo)記肽段的質(zhì)譜裂解行為的研究,發(fā)現(xiàn)金屬標(biāo)簽在二級(jí)碎裂過(guò)程中十分穩(wěn)定,碎片離子主要為連續(xù)的y離子和部分b離子,因而有利于未知肽段的定性鑒定,適于復(fù)雜生物樣本的分析。
　　然后,本研究建立了基于ESI-MS技術(shù)的金屬

6、元素標(biāo)記蛋白質(zhì)組多重相對(duì)定量新方法。先胍基化肽段的賴氨酸側(cè)鏈氨基,僅對(duì)N-端氨基進(jìn)行金屬元素標(biāo)記,然后結(jié)合ESI-LTQ-FT-MS/MS進(jìn)行四重相對(duì)定量分析。通過(guò)對(duì)四重金屬元素標(biāo)記肽段的色譜-質(zhì)譜行為考察,結(jié)果表明四重金屬元素標(biāo)記肽段具有相同的色譜保留和二級(jí)質(zhì)譜裂解行為。與肽段原型相比,金屬元素標(biāo)記肽段的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子中,除連續(xù)的y-系列離子外,b系列離子的信號(hào)得到改善,提高了未知肽段定性鑒定的可靠性。以標(biāo)準(zhǔn)肽段和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物為

7、模型的相對(duì)定量研究結(jié)果表明:該方法在0.1～10倍動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(R2=0.99),在10倍差異內(nèi),對(duì)六種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物的四重相對(duì)定量的百分比誤差為13%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)在20%以內(nèi),表明該定量方法具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和精密度,顯示了該定了方法在復(fù)雜生物樣本的良好的應(yīng)用價(jià)值。
　　最后,本研究將金屬元素標(biāo)記結(jié)合納升源反相高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振串聯(lián)質(zhì)

8、譜(nano-RP-HPLC-LTQ-FT-MS/MS)技術(shù)的多重相對(duì)定量策略初步應(yīng)用于四個(gè)不同溫度培養(yǎng)的騰沖嗜熱菌蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量研究。通過(guò)MaxQuant軟件定性鑒定和定量計(jì)算,在99%置信度和至少兩個(gè)非冗余肽段定量一個(gè)蛋白質(zhì)的條件下,共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著(倍數(shù)<0.5或>2)的13個(gè)蛋白質(zhì),其中8個(gè)蛋白質(zhì)隨著騰沖嗜熱菌的培養(yǎng)溫度的升高而表達(dá)量逐漸上調(diào);相反地,另外5個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)。13個(gè)差異蛋白中有7個(gè)蛋白質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道