磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化修飾是最常見(jiàn)，最重要的的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的所有關(guān)鍵過(guò)程。同時(shí)磷酸化的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致很多嚴(yán)重的人類疾病，如癌癥，糖尿病，心臟病，老年癡呆癥等。因此，蛋白質(zhì)磷酸化研究一直以來(lái)都是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)，同時(shí)用蛋白質(zhì)組學(xué)的策略研究生物體的磷酸化修飾也是功能蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。由于磷酸化蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的含量很低，對(duì)它的檢測(cè)和位點(diǎn)分析一直是蛋白質(zhì)組學(xué)的難點(diǎn)，而磷酸化蛋白質(zhì)的大規(guī)?；?/p>

2、析和位點(diǎn)鑒定更是磷酸化蛋白質(zhì)組研究面臨的巨大挑戰(zhàn)。神經(jīng)干細(xì)胞在生命活動(dòng)中執(zhí)行了多種重要的生理功能，具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景，因此其磷酸化研究有助于人們深入的理解和認(rèn)識(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的復(fù)雜功能以及蛋白質(zhì)磷酸化在神經(jīng)干細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)等生物過(guò)程中的意義。
　　 本論文的工作包括3個(gè)方面：1）基于一種全新的化學(xué)標(biāo)記試劑和生物質(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)分析方法的建立;2）磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的建立;3）大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)在小

3、鼠神經(jīng)干細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。
　　 第一部分以標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)為樣本建立了蛋白質(zhì)磷酸化修飾分析技術(shù)體系：自主設(shè)計(jì)并合成了一種新的磷酸化特異性標(biāo)記試劑MPAE(4-甲基哌嗪乙酰乙二胺);通過(guò)對(duì)肽段的酯化，標(biāo)記有效的將標(biāo)記試劑引入到磷酸化基團(tuán);最后用串聯(lián)質(zhì)譜分析區(qū)分磷酸化肽段和非磷酸化肽段，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定確定磷酸化位點(diǎn)。
　　 第二部分建立了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及其處理平臺(tái)，通過(guò)對(duì)搜庫(kù)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，

4、確立了嚴(yán)格的搜尋條件，保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，為大規(guī)模，高通量的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)，此外，我們編寫了適合我們實(shí)驗(yàn)方法的磷酸化定位程序，為接下來(lái)的磷酸化定位分析鋪平了道路。
　　 第三部分利用所建立的磷酸化蛋白質(zhì)分析方法大規(guī)模的分析了小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(C17.2cell)提取的全蛋白質(zhì)中的磷酸化蛋白質(zhì)，共鑒定出337個(gè)磷酸化肽，405個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別歸屬于259個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，其中有18個(gè)磷酸化位點(diǎn)是文獻(xiàn)中沒(méi)有報(bào)道