差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫與大規(guī)模蛋白質(zhì)磷酸化化學(xué)定量的方法學(xué)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是以系統(tǒng)和動態(tài)的觀點研究蛋白質(zhì)及其相互作用的一門新興科學(xué)。它以樣品的分離和制備技術(shù)為基礎(chǔ)，以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心，以生物信息學(xué)為支撐，試圖實現(xiàn)對蛋白質(zhì)組高通量、全方位的定性、定量和定位研究。本論文涉及的研究工作主要集中在以下兩個方面：1)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫的開發(fā)，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的制定，功能注釋體系的構(gòu)建；2)大規(guī)模蛋白質(zhì)磷酸化化學(xué)定量的方法學(xué)研究。本論文將對這兩部分工作進(jìn)行總結(jié)。 第一部分介紹差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(DEPD)

2、的構(gòu)建和使用。比較蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)是系統(tǒng)比較兩種細(xì)胞狀態(tài)(如疾病和正常狀態(tài))之間的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，關(guān)注由疾病或者是環(huán)境因子作用引起的蛋白質(zhì)量的變化。隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，大量蛋白質(zhì)差異表達(dá)數(shù)據(jù)被發(fā)表在各類非格式化文獻(xiàn)中。盡管這些數(shù)據(jù)對于尋找生物標(biāo)記物和藥物靶點很有價值，但不幸的是很少有人把它們整合成格式統(tǒng)一的數(shù)據(jù)資源。目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫。這種現(xiàn)狀阻礙了科學(xué)家從比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果中獲得可靠而有價值的信息

3、。為此開發(fā)了DEPD數(shù)據(jù)庫來儲存這些信息。人工提取了來自104篇文獻(xiàn)的3266個差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息。所有這些蛋白質(zhì)差異表達(dá)信息都附有詳細(xì)的樣本、外界環(huán)境以及試驗方法學(xué)描述，以確保這些差異表達(dá)數(shù)據(jù)能被正確解讀。為了統(tǒng)一“比較蛋白質(zhì)組學(xué)”產(chǎn)出數(shù)據(jù)的格式，我們提出了比較蛋白質(zhì)組學(xué)模型(CPXS 0.1)。它定義了描述一個比較蛋白質(zhì)組學(xué)試驗所需的最小信息需求，是DEPD的數(shù)據(jù)模型。為了方便數(shù)據(jù)查詢和提交，設(shè)計了一個界面友好的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，提供了一

4、系列較為完備的蛋白質(zhì)功能分析工具。 第二部分主要介紹大規(guī)模蛋白質(zhì)組磷酸化化學(xué)定量檢測的方法學(xué)研究。蛋白質(zhì)組磷酸化研究一直以來都是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點和難點。以往的蛋白質(zhì)組磷酸化研究一般集中于:1)磷酸化蛋白，肽段以及磷酸化位點的鑒定；2)磷酸激酶、磷酸酯酶與其底物之間的相互作用；3)磷酸化肽段(蛋白)的定量和動態(tài)變化的研究。而測量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的化學(xué)定量(即磷酸化比例)卻是一個被人忽視而又非常重要的科學(xué)問題。以往發(fā)表的少數(shù)關(guān)

5、于磷酸化化學(xué)定量的研究都局限在細(xì)胞外或者少數(shù)幾種磷酸化蛋白上。因此開發(fā)一種可靠的大規(guī)模確定細(xì)胞內(nèi)磷酸化化學(xué)定量的方法是蛋白質(zhì)組磷酸化研究走向深入的重要一環(huán)。以Hela細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿為材料，采用密度梯度離心、SDS-PAGE等方法初步富集目的蛋白，酶解后用16O水和18O水分別標(biāo)記完全去除磷酸化和未經(jīng)處理的兩個相同細(xì)胞組分。運用Bruker UltraFlex TOF/TOF MS質(zhì)譜儀，通過比較兩者之間各肽段豐度的差異找到磷酸化肽段