C57BL-6J小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組研究技術(shù)方法構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)等諸多生命過程中最普遍也是最重要的調(diào)控手段之一[1]，在生物學(xué)功能研究領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。以質(zhì)譜技術(shù)為核心的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法可以系統(tǒng)、規(guī)?；貙?fù)雜體系中的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析，從而為與蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)的各種生物學(xué)功能研究提供通量化的技術(shù)平臺和極有價值的數(shù)據(jù)集。但由于蛋白質(zhì)的磷酸化修飾含量少、化學(xué)計量值低、質(zhì)譜檢測

2、離子化效率低，使得磷酸肽的質(zhì)譜檢測較為困難，且在復(fù)雜生物樣本中大量高豐度、非磷酸化肽段的存在進(jìn)一步抑制了磷酸肽的質(zhì)譜信號，若對生物樣品直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，磷酸肽的檢出率較低，因此在質(zhì)譜檢測前，對磷酸化肽段進(jìn)行相對的分離富集是必不可少的步驟之一。
　　 金屬氧化物富集法，特別是二氧化鈦富集法，由于對磷酸肽富集效果好，且價格低廉，操作簡便，是使用最為廣泛的磷酸肽富集方法之一。但是由于二氧化鈦除了可以吸附磷酸基團(tuán)，對天冬氨酸(D)及谷氨

3、酸(E)這樣的酸性氨基酸也有一定的吸附作用。因而在富集磷酸肽的同時，富含天冬氨酸及谷氨酸殘基的非磷酸肽也常常隨著磷酸肽一起被富集，對磷酸肽的質(zhì)譜檢測造成一定的干擾。為了減少這些非磷酸肽與二氧化鈦的結(jié)合，常常在上樣緩沖液中加入一些非磷酸肽吸附抑制劑來降低樣本的非特異性吸附，從而提高富集的選擇性。
　　 本研究對二氧化鈦這種常用的金屬氧化物富集法進(jìn)行了富集條件的優(yōu)化，引入天冬氨酸作為新型的非磷酸肽吸附抑制劑，并使用復(fù)雜生物樣本對優(yōu)化

4、的富集條件進(jìn)行了評價。使用這種經(jīng)過優(yōu)化的富集方法結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離方法，得到了模式生物C57/BL6J小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對小鼠肝臟部分細(xì)胞器磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了大規(guī)模的獲取及相應(yīng)的生物信息學(xué)分析。該種模式生物的肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚屬空白，數(shù)據(jù)獲取及相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析對后續(xù)深入研究磷酸化蛋白在肝臟生理過程中的重要作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　 論文第一部分，論述了在前期工作的基礎(chǔ)上

5、，對二氧化鈦富集磷酸肽方法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化和評價，確立了以天冬氨酸作為新型非磷酸肽吸附抑制劑的二氧化鈦富集方法。作者分別使用3種、9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物作為研究對象，比較了不同的非磷酸肽吸附抑制劑在相同反應(yīng)條件下的冗余/非冗余肽段及選擇性情況，證明了天冬氨酸作為非磷酸肽吸附抑制劑的有效性及優(yōu)越性。此后，將優(yōu)化后的該方法用于富集鼠肝全蛋白混合酶切肽段產(chǎn)物，同樣取得了很好的效果。富集的選擇性較未添加非磷酸肽吸附抑制劑有著顯著的提高。進(jìn)一步證實了

6、使用該種非磷酸肽吸附抑制劑的優(yōu)化的富集方法在復(fù)雜樣本中應(yīng)用的可靠性。
　　 論文第二部分，論述了使用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法作為預(yù)分離的手段，結(jié)合優(yōu)化后的二氧化鈦富集方法獲取了C57BL/6J小鼠肝臟全蛋白磷酸化修飾譜數(shù)據(jù)集。作者采用制各級凝膠電泳分離小鼠肝臟全蛋白提取物，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色方法顯色，將凝膠等分為15個條帶組分并分別進(jìn)行酶解，使用第一部分中優(yōu)化的二氧化鈦富集方法對膠內(nèi)提取的肽段進(jìn)行富集并進(jìn)行質(zhì)譜檢測。為了獲得更加全

7、面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)集，我們對數(shù)據(jù)檢索條件進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化，最終確定最佳數(shù)據(jù)檢索條件為：母離子質(zhì)量精度設(shè)置為10 ppm，胰酶酶切方式設(shè)置為全酶切，子離子質(zhì)量精度設(shè)置為0.8 Da。通過該種最優(yōu)檢索條件，共獲得1778個非冗余磷酸化肽段，2417個磷酸化位點和1031個磷酸化蛋白；鑒定到的磷酸化位點中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的比例分別為85％、13％、2％，符合文獻(xiàn)報道范圍。此外還進(jìn)行了GO分類等一些簡單的數(shù)據(jù)分析。本部分實驗結(jié)果及分析證明了該技

8、術(shù)路線用于大規(guī)模獲取磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可行性和有效性。
　　 論文第三部分，論述了使用已確立并成功獲取小鼠肝臟全蛋白磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的技術(shù)路線，對C57BL/6J小鼠肝臟部分細(xì)胞器進(jìn)行了分離和磷酸化譜數(shù)據(jù)集的獲取。將全蛋白與細(xì)胞器數(shù)據(jù)整合后，共獲得2442個非冗余磷酸化肽段，3394個磷酸化位點和1402個磷酸化蛋白。針對該數(shù)據(jù)集，作者進(jìn)行了深入系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，如數(shù)據(jù)集間的比對分析、GO分類、Motif分析、通路