基于功能磁性材料的蛋白質(zhì)組學(xué)分離鑒定新方法研究.pdf

1、本論文針對目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨的分離富集及鑒定方面的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，將功能磁性材料與蛋白質(zhì)分析結(jié)合起來，開展了一系列研究工作，發(fā)展了相關(guān)的新技術(shù)新方法并進(jìn)行了實(shí)際的應(yīng)用研究，取得了一些創(chuàng)新性研究結(jié)果。主要研究內(nèi)容和取得的主要研究成果摘要如下： 第一章概述了蛋白質(zhì)組學(xué)目前分離鑒定研究的主要技術(shù)手段及分離富集新技術(shù)研究的發(fā)展趨勢；概述了磁性聚合物微球的特點(diǎn)及其應(yīng)用；就功能材料應(yīng)用于分離富集低豐度蛋白和翻譯后修飾蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行

2、了綜述；提出了本論文選題的目的和意義。 第二章針對低豐度蛋白及肽段的分離鑒定，采用水熱法制備了具有超順磁性的四氧化三鐵磁性微球；采用溶膠．凝膠法在其表面包覆二氧化硅層，合成制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe<,3>O<,4>@SiO<,2>磁性硅球；并在其表面進(jìn)行硅烷化修飾。利用振動樣品磁場計(jì)、傅立葉變換紅外光譜儀、透射及掃描電子顯微鏡、熱失重分析儀等對我們制備的C8鍵合相疏水性硅球磁性材料C8-f-Fe<,3>O<,4>@SiO<,2>

3、進(jìn)行了表征。該材料的硅層表面與報(bào)道過的同類材料的聚合物表面相比，具有更好的生物相容性。將其應(yīng)用于富集低豐度肽段，富集倍數(shù)達(dá)到100倍以上；即使對高濃度的鹽溶液中的肽段仍能實(shí)現(xiàn)有效富集。進(jìn)一步用于血清中游離低豐度肽段的分離富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對于血清中游離肽段的富集效果達(dá)到并超過了已經(jīng)報(bào)道的同類材料的效果。 第三章針對翻譯后修飾蛋白質(zhì)組中的磷酸化蛋白及肽段的分離富集問題，采用固定金屬親和色譜(IMAC)原理，在Fe<,3>O<,

4、4>＠SiO<,2>磁性硅球表面鍵合上螯合金屬離子的官能團(tuán)，將Fe(III)固定在磁球表面。采用傅立葉變換紅外光譜儀等對其進(jìn)行了表征與確認(rèn)。 以β-casein標(biāo)準(zhǔn)蛋白為測試對象，實(shí)驗(yàn)證明該材料對于磷酸化肽段具有很好的選擇性富集效果，信躁比可提高10倍以上。實(shí)驗(yàn)得到了該材料選擇性富集磷酸化肽段的最佳條件并考察了該材料對于混合蛋白酶解肽段體系中磷酸化肽段的選擇性富集性能，富集到的磷酸化肽可洗脫分析也可無需洗脫直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，顯示

5、了該方法的靈活性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用于人血清中游離的磷酸化肽段的富集，并采用質(zhì)譜進(jìn)行了磷酸化肽段結(jié)構(gòu)以及磷酸化位點(diǎn)的鑒定，獲得了一批磷酸化肽段數(shù)據(jù)。以鼠肝蛋白提取物為研究對象，將提取蛋白酶解得到的鼠肝肽段混合物，分別采取兩條技術(shù)路線進(jìn)行分離鑒定：(a)將肽段混合物中所有的磷酸化肽段富集到材料上，將其洗脫，進(jìn)行nanoLC-LTQ MS/MS分析，鑒定了66條磷酸化肽段。(b)將肽段混合物進(jìn)行色譜分離，按時(shí)間收集29個餾分，降低了富集體

6、系的復(fù)雜性后再用材料富集各個餾分中的磷酸化肽，對每個餾分中富集到的磷酸化肽段采用MALDI TOF MS進(jìn)行磷酸化肽段及其位點(diǎn)的鑒定，顯示了該材料對磷酸化肽段具有較好的選擇性和適用性。論文還發(fā)展了更為簡便的方法，合成了氨基四氧化三鐵磁性納米材料，在其表面鍵合上螯合金屬離子的官能團(tuán)，將Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga(Ⅲ)、In(111)、Zr(IV)、Ce(Ⅲ)等離子固定到磁球表面。通過傅立葉變換紅外光譜儀、能量彌散X射線分析儀等對其進(jìn)行表

7、征。考察了表面固定Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga((Ⅲ)、In(Ⅲ)、Zr(IV)、Ce(Ⅲ)等離子的氨基四氧化三鐵磁性納米材料對于磷酸化肽段的選擇性富集能力，結(jié)果表明，所有材料對于磷酸化肽段都有較好的分離富集選擇性，其中Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga(Ⅲ)和Zr(IV)較In(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)的選擇性更加突出。 第四章研究探索了二氧化鈦的包覆新方法，采用磁球外部包覆碳層為模板包覆二氧化鈦、隨后灼燒去除碳層的方法，制備了結(jié)構(gòu)緊密的具

8、有核殼結(jié)構(gòu)的Fe<,3>O<,4>＠TiO<,2>超順磁性微球。該新材料具有與IMAC材料完全不同的富集機(jī)理，且具有更高的化學(xué)惰性和穩(wěn)定性。采用振動樣品磁場計(jì)、傅立葉變換紅外光譜儀、透射及掃描電子顯微鏡等對產(chǎn)物進(jìn)行了表征與確認(rèn)。該合成新方法為在磁球表面包覆其他金屬氧化物提供了很好的借鑒作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)而優(yōu)化了該材料富集磷酸化肽段的實(shí)驗(yàn)條件，包括富集體系、富集時(shí)間、樣品洗脫時(shí)間等，驗(yàn)證了該材料對于復(fù)雜體系中磷酸化肽段有很好的選擇性富集性能。并

9、將其應(yīng)用于人血清磷酸化肽富集和鼠肝蛋白中磷酸化肽鑒定，獲得了79條磷酸化肽段的數(shù)據(jù)。 第五章針對翻譯后修飾蛋白中糖基化蛋白及肽段的分離富集問題，論文研究制備了表面鍵合硼酸基團(tuán)/ConA凝集素的氨基磁性納米粒子新材料，采用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行表征；對該材料應(yīng)用于糖基化蛋白的選擇性富集進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)探索，實(shí)現(xiàn)了對糖蛋白的選擇性富集，獲得了有價(jià)值的研究結(jié)果。論文還研究了糖蛋白的酶解方法，優(yōu)化了酶解的條件，采用色譜分離的方法獲得了目