人肺腺癌蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、肺癌是目前全世界最為常見的惡性腫瘤之一，作為威脅全世界人類健康的重大疾病，其發(fā)病率占所有新發(fā)現(xiàn)癌癥患者的12.6％，死亡率占癌癥死亡總數(shù)的17.8％，且呈逐漸上升趨勢。根據(jù)WHO估計二十一世紀我國將成為肺癌發(fā)病率較高的國家之一。肺癌依據(jù)其組織病理學可分為兩大類：小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌又包含鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。其中，腺癌近年來的發(fā)病率有不斷上升的趨勢。肺腺癌作為肺癌發(fā)病的常見類型，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因及

2、多途徑改變的復雜過程，雖然從基因和轉(zhuǎn)錄水平已對其進行了許多成功的研究，但其癌變機制仍不十分明確，尚缺乏有效的用于肺腺癌早期診斷和預后監(jiān)測的生物分子標志物，若能直接從蛋白質(zhì)組入手來研究肺腺癌將可更全面、真實地揭示肺腺癌變的本質(zhì)，為肺癌的發(fā)病及其防治研究開辟新的思路、提供新的線索。 本研究以人肺腺癌組織和配對癌旁正常肺組織為研究材料，采用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)并采用免疫組化技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的差異表達蛋白質(zhì)進行驗證。

3、 (一)對20例人肺腺癌組織和配對癌旁正常肺組織進行比較蛋白質(zhì)組學研究。首先，提取人肺腺癌組織和配對癌旁正常肺組織的總蛋白，經(jīng)2D Quant One試劑盒準確定量后，利用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離人肺腺癌組織和癌旁正常肺組織的總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍顯色后經(jīng)圖像分析軟件識別差異表達蛋白質(zhì)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜和四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀鑒定差異表達的蛋白質(zhì)點。結(jié)果如下：(1)以24cm固相pH梯度膠條(pH 3-10

4、)進行人肺腺癌組織和配對癌旁正常肺組織總蛋白的分離，得到了分辨率較高、重復性較好的人肺腺癌組織和癌旁正常肺組織雙向凝膠電泳圖譜。人肺腺癌組織和癌旁正常配對肺組織各3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為1052±48和1037±57，同一癌組織3塊不同雙向電泳凝膠之間蛋白質(zhì)點在等電聚焦方向的偏差是0.814±0.103，在SDS-PAGE方向上的偏差為1.052±0.185；(2)用PDQUEST分析軟件對20例肺腺癌組織及癌旁配對正常肺組織的雙

5、向凝膠電泳圖譜進行了分析，平均匹配的點數(shù)為1006±54，共找到表達差異兩倍以上的蛋白質(zhì)斑點28個；(3)分別應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀和四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對這28個差異蛋白質(zhì)點進行準確鑒定，共鑒定出20個非冗余蛋白質(zhì)，上調(diào)蛋白質(zhì)13個、下調(diào)蛋白質(zhì)7個，其中一些為與細胞信號通路，細胞代謝酶類等有關(guān)的肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)。 (二)為了驗證蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的可靠性，采用免疫組織化學技術(shù)對3個肺腺癌相關(guān)蛋白(14-3-3

6、Sigma蛋白、膜聯(lián)蛋白1和錳超氧化物岐化酶)在肺腺癌、肺腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、正常肺組織和肺炎性假瘤中的差異表達情況進行了驗證。結(jié)果顯示14-3-3Sigma蛋白、膜聯(lián)蛋白1和錳超氧化物岐化酶在人肺腺癌組織和肺腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達明顯高于在正常肺組織以及炎性假瘤中的表達，P<0.05，這表明免疫組織化學的分析結(jié)果與蛋白質(zhì)組的分析鑒定結(jié)果一致。 本研究采用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)系統(tǒng)地對肺腺癌組織進行了研究，通過對肺腺癌組織、配對的癌旁正常

7、肺組織的蛋白表達譜進行比較，在國內(nèi)首次進行人肺腺癌的差異表達蛋白質(zhì)組學研究，對肺腺癌組織中總蛋白質(zhì)的抽提方法和上樣量進行了摸索，確定了重復性較好的實驗方法，并成功鑒定出20個非冗余的與肺腺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)；采用免疫組織化學技術(shù)對14-3-3Sigma蛋白、膜聯(lián)蛋白1和錳超氧化物歧化酶在肺腺癌、肺腺癌所致的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、正常肺組織和肺炎性假瘤中的表達情況進行了驗證，結(jié)果表明這三種蛋白質(zhì)在肺腺癌、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的表達明顯高于在正常組織、炎性假瘤中的